PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

[目的]建立PIWIL1基因启动子调控的特异性表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制奠定基础。[方法]通过PCR扩增,从猪的全基因组上扩增出PIWIL1基因的启动子。切除猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor的启动子MHC,将其与PIWIL1基因启动子连接,构建成特异性表达Cre重组酶的pPIWIL1-Cre载体。将该载体转染小型猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得阳性克隆进行核移植。[结果]获得2头PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre酶的转基因猪。[结论]成功构建了PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制提供了工具猪。     

sFat-1转基因猪遗传稳定性和7种疾病易感性测试(英文)

[目的]测试sFat-1转基因猪的遗传稳定性,以及对7种疾病的易感性差别。[方法]采用PCR法检测传代仔猪sFat-1基因整合情况,并用ELISA和PCR法检测转基因猪对伪狂犬病、钩端螺旋体病、猪密螺旋体痢疾、布鲁氏菌病、轮状病毒、结核杆菌病和猪支原体肺炎的感染情况。[结果]sFat-1转基因猪F3代仔猪阳性比例为18.5%,转基因阳性猪和阴性猪对7种疾病的易感性没有明显差别。[结论]sFat-1转基因猪外源基因遗传不稳定,转基因阳性和阴性猪体质整体情况接近。     

精子与慢病毒孵育制备转基因猪的分子检测及遗传分析

【目的】在前期精子与慢病毒孵育法制备的转基因猪基础上,进一步探讨外源基因在转基因猪上的遗传状况.【方法】通过转基因猪与野生猪交配扩繁后,运用PCR和Southern-blot法对转基因G_1和G_2代进行外源基因的检测与遗传分析.【结果和结论】采用PCR法检测,G_1代PCR阳性率为25.42%(15/59);G_2代PCR阳性率为46.67%(7/15).在12头阳性转基因猪的13种组织中,外源基因在多种组织中均有存在;对阳性转基因猪的胃、垂体、下丘脑组织的RT-PCR检测结果显示,外源基因在66.67%(24/36)的组织样品中均有表达.表明在精子与慢病毒共孵育法制备的转基因猪中,外源基因能整合到猪的基因组,并遗传给后代.     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

Dot-blot对转DAF基因猪外源基因整合的检测

衰变加速因子(DAF)是补体激活途径中的一个重要膜调节蛋白，转人DAF基因猪可以作为人器官移植的供体。采用斑点杂交试验(Dot-blot)，对经显微注射导入了hDAF质粒片段、用聚合酶链反应(PCR)鉴定的阳性猪所产仔猪32头进行了整合检测，获得转基因阳性仔猪14头。说明了Dot-blot可作为转基因动物外源基因整合检测的一种手段。     

嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体鉴定

本研究目的在于对实验室优化构建的嗜热菌β-糖苷酶基因乳腺特异性表达载体PLOX-LacS的功能进行鉴定,检测目的基因能否正常表达。实验通过脂质体介导方法将载体质粒转染小鼠的乳腺癌细胞,筛选获得的阳性细胞通过PCR和RT-PCR的方法进行嗜热菌β-糖苷酶基因的整合检测和表达检测。基因整合PCR鉴定结果表明小鼠乳腺癌细胞基因组中整合有嗜热菌糖苷酶基因,目的片段大小为1203bp;RT-PCR表达鉴定结果显示,目的片段大小与预期相同,说明诱导后的小鼠乳腺癌细胞表达了完整的嗜热菌β-糖苷酶基因。实验表明该载体能够使目的基因整合在乳腺细胞基因组中并特异性表达。为后期生产转基因奶牛提供实验材料。     

抗稻瘟病基因Pib4的转基因研究

[目的]探讨抗稻瘟病基因Pib4的转基因。[方法]利用PCR法克隆Pib基因的NBS功能结构域到双元载体pCAMBIA1301上,以粳稻品种农大18的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,采用农杆菌介导法转化Pib4基因。[结果]经PCR和GUS活性检测表明外源基因已整合到水稻基因组中并获得表达;用稻瘟病菌接种阳性植株,获得了抗稻瘟病菌的水稻植株。[结论]为合理利用抗病基因和育种提供了参考。     

禽流感H5N1型神经氨酸酶在细胞中的表达

利用表达载体pIRES-NA研究H5N1型神经氨酸酶(neuramidinase,NA)基因在NIH-3T3细胞中表达,为今后转基因家禽的培育提供证据.通过构建重组表达载体转染细胞经G418筛选后,利用PCR方法检测NA基因在细胞基因组中整合,利用 RT-PCR和Western Blotting的方法分别在RNA及蛋白质水平上检测NA基因在细胞中表达.结果表明细胞转染经筛选后,提取细胞基因组进行PCR,能扩增出NA基因片段,约1.4 kb;同时RT-PCR能检测到NA基因mRNA,Western Blotting能检测到细胞表达约55 ku NA蛋白,构建重组载体能整合到NIH-3T3细胞基因组中,NA基因能在细胞中表达.     

转β-甘露聚糖酶基因克隆猪的制备与分析

【目的】将前期构建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的质粒p PSPBGP-manA转染杜洛克猪胎儿成纤维细胞,利用G418筛选出转基因细胞系,通过体细胞核移植方法生产出转manA基因猪,利用分子生物学方法对转基因猪进行阳性鉴定、基因及蛋白表达水平的检测,同时测定转基因猪唾液β-甘露聚糖酶酶活、粪便营养物质含量,旨在为生产及进一步研究转manA基因猪提供一些科学依据。【方法】用限制性内切酶Not I将质粒p PSPBGP-manA线性化并通过脂质体法将其转入杜洛克猪胎儿成纤维细胞,然后用不同浓度的G418进行筛选、维持培养,将筛选后的细胞进行体细胞核移植生产克隆猪;克隆猪出生后采取尾组织样用酚-氯仿法提取基因组DNA进行PCR及Southern blotting鉴定阳性转基因猪;收集转基因猪唾液并利用DNS法进行β-甘露聚糖酶活性测定,同时收集转基因猪粪便测定粪便中营养物质含量;取转基因猪的腮腺、颌下腺、舌下腺、心脏、肝脏等组织并用Triol法提取RNA,然后进行RT-PCR鉴定manA基因的表达,再进行相对定量PCR检测manA基因在不同个体及组织间的表达差异;通过Western blotting技术分析转基因猪外源性manA基因的蛋白表达水平。【结果】经G418筛选后进行PCR鉴定得到阳性转基因细胞系;通过体细胞核移植方法生产出21头克隆猪,经PCR及Southern blotting鉴定出16头转基因猪,阳性率为76%;转基因猪唾液中β-甘露聚糖酶的活性为(0.092±0.003)U·m L-1,粪便中粗蛋白含量明显降低;经RT-PCR、相对定量PCR鉴定,manA基因在转基因猪腮腺和舌下腺组织中特异表达,其它组织不表达,腮腺组织表达量高于舌下腺组织;Western blotting检测发现在腮腺和舌下腺组织中有manA的表达。【结论】通过G418筛选得到转manA基因细胞系并成功得到转manA基因猪,外源manA基因能够在转基因猪中腮腺和舌下腺组织特异性表达,为转manA基因猪的生产及进一步研究奠定了基础。     

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

[目的]为研究水稻中的SLR1蛋白的功能及寻找与其相互作用的GA信号转导蛋白奠定基础。[方法]以水稻品种日本晴基因组DNA为模板,根据水稻SLR1基因cDNA序列设计1对特异引物进行PCR扩增,回收PCR产物连接到pGEMT载体中,经筛选得到水稻SLR1基因的克隆pGEMTSLR。最后采用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法构建水稻SLR1基因的正义和反义表达载体。[结果]通过PCR扩增获得了约为1.9kb的特异片段。回收PCR产物,将克隆片段和pGEMT载体连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,重组克隆经酶切鉴定后提取重组质粒pGEMTSLR1。该研究成功构建了SLR1基因的正义表达载体pCAMSLR(约0.7kb)和反义表达载体pCAMASLR(约1.2kb)。[结论]采用冻溶法可将表达载体pCAMSLR和pCAMASLR导入农杆菌并进行水稻的遗传转化。利用SLR1基因的正义和反义表达载体,可观察转基因植株中该基因的表达上调和下调对植物的影响。     

农杆菌介导的双SBE基因RNAi载体对水稻的遗传转化

[目的]提高水稻中直链淀粉的含量,扩大稻米的利用范围。[方法]以水稻中花11品种为材料,通过农杆菌介导法,侵染水稻幼胚诱导出的愈伤组织,将淀粉分支酶基因SBE1和SBE3同时导入受体愈伤组织,经过一系列的共培养、预分化、分化、生根壮苗后,获得含有转基因的转化植株,并对转化植株进行PCR鉴定。[结果]通过用根癌农杆菌介导法,侵染由水稻幼胚诱导的274粒愈伤组织,经过共培养、筛选,得到177粒抗性愈伤,然后将抗性愈伤预分化、分化得到103株分化苗,生根壮苗后获得49株转基因植株;从49株转基因植株中随机提取34株的基因组DNA,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了片段大小约为500 bp的潮霉素基因序列。[结论]初步证实转基因植株的真实性,淀粉分支酶基因SBE1+SBE3成功整合进入水稻基因组中。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析（摘要）（英文）

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440 bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440 bp）、AB型（3条带：440、282、158 bp）、BB型（2条带：282、158 bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B 2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

慢病毒生产卵泡抑素转基因绵阳PCR检测方法的建立(英文)

[目的]建立稳定快速的慢病毒转基因羊DNA水平检测方法。[方法]采集初生转基因羔羊的子叶、脐带、尾组织以及死亡羔羊的全身各组织,提取基因组DNA作为模板进行PCR检测,以Follistatin基因N+D1片段特异性引物进行PCR检测;同时,对慢病毒载体的CMV启动子、5’-LTR等结构元件进行PCR检测;提取死亡羔羊的全身组织以及转基因羔羊的活体肌肉组织总RNA,进行RTPCR检测。[结果]采用试剂盒提取的基因组DNA比常规方法提取的DNA快速、高效,且更易被检测,扩增时的引物采用载体上游与目标基因下游的组合大大增加了检测的特异性,避免了内源性目标基因的干扰而造成假阳性;初生转基因羔羊的尾组织可作为PCR检测的组织样品,其结果可靠、准确;对CMV启动子及5’-LTR等结构元件作PCR检测为转基因动物的安全性考察提供了数据,同时验证了转基因羔羊目的基因的检测结果;对转基因羔羊肌肉组织提取总RNA后进行RT-PCR检测,其中有3只羔羊没有检测到转录产物,其他均有转录。[结论]该研究建立的转基因绵羊PCR检测方法高效、快速且准确,为进一步蛋白水平检测提供试验依据,也为建立转基因绵羊系统性多层次的检测方法奠定基础,还为转基因绵羊的安全监测提供了稳定的技术平台。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440bp）、AB型（3条带：440、282、158bp）、BB型（2条带：282、158bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

转TGEV-S基因玉米中目的基因的PCR检测及优化

为提高转基因玉米中目的基因的检出效率,以猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白（TGEV-S）转基因玉米为材料,利用PCR方法检测样品中的目的基因.通过对PCR反应体系中4种不同DNA聚合酶和8种退火温度进行比较,建立和优化了转基因玉米中TGEV-S基因的PCR检测方法.对450株转基因玉米叶片DNA和种子DNA中的TGEV-S基因片段进行检测,并设计33对引物检测插入转基因玉米基因组DNA中的质粒pBAC9020DNA片段.结果显示,LA Taq酶对叶片DNA和种子DNA中TGEV-S片段的PCR扩增敏感性和特异性均优于其他Taq聚合酶,且退火温度为53～55℃时扩增效果较好.分别对450份转基因玉米叶片DNA和种子DNA检测结果显示阳性率分别为82.5％和76.3％.利用33对引物进行的PCR扩增及测序结果显示质粒pBAC9020基因片段已全部插入该玉米基因组DNA中.本试验建立的转TGEV-S基因玉米PCR检测方法敏感性和特异性高,为转基因玉米阳性植株的检测奠定了坚实的基础.     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

cNHX1基因转化草莓的研究

[目的]探讨将完整的含柑橘cNHX1基因转化为草莓植株。[方法]以弗吉尼亚草莓品种为试材构建了含柑橘cNHX1基因的植物表达载体,并进行了酶切鉴定,然后将表达载体导入农杆菌EHA105中,获得了工程菌株;利用农杆菌转化法,把cNHX1基因转化成草莓植株,并利用PCR方法鉴定了转化植株。[结果]利用农杆菌转化法获得了转cNHX1基因,通过进一步利用含Kam的平板进行筛选,获得了纯合的转基因植株;对获得的转基因草莓植株提取叶片DNA,利用引物F01和R02进行扩增,结果在草莓基因组中可以扩增出1.63kb的目的条带,证明cNHX1基因已经整合到草莓基因组。[结论]为获得耐盐程度显著提高的转基因草莓奠定了初步基础。     

河南华溪蟹金属硫蛋白原核表达载体的构建

[目的]构建河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）金属硫蛋白（MT）的原核表达载体。[方法]以大肠杆菌DH-5α中的pGEM-MT质粒为模板,PCR扩增目的片段并连接至pGEM-T载体。然后,亚克隆至pQE31表达载体,转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。[结果]PCR扩增目的片段产物大小约为220 bp,与预期大小一致。重组质粒pQE31-MT双酶切鉴定结果也与预期相符。[结论]成功构建了MT原核表达载体,为今后表达并纯化MT提供了材料。