农杆菌介导美味猕猴桃基因转化影响因素研究

[目的]建立美味猕猴桃叶片外植体转化体系,为猕猴桃遗传转化研究奠定良好基础.[方法]以美味猕猴桃组培苗叶片为材料,研究不同浓度乙酰香酮（AS）对外植体β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）瞬时表达阳性率的影响,及暗培养时间与抗褐化剂二硫苏糖醇（DTT）、聚乙烯呲咯烷酮（PVP）对外植体褐化、抗性芽诱导的影响.[结果]仅在侵染菌液中添加AS时,100、150、200 μmol/L AS 3个处理的外植体GUS阳性率均极显著高于对照,分别为14.6％、16.7％、10.7％;而当农杆菌侵染液与共培养基中同时添加100～150μmol/L AS,可使GUS瞬时表达阳性率提高至37.9％.选择培养初期经过2～12 d暗培养后,外植体褐化率不断下降,抗性芽诱导率不同程度提高,其中以暗培养6、8d处理的褐化率相对较低,分别为33.2％和30.6％,且相应的抗性芽诱导率最高,分别为14.2％和13.1％,极显著高于其他处理与对照.在分化培养基中添加1.0～2.0 g/L的DTT并暗培养6d的效果优于对应浓度的PVP;其中1.5 g/L DTT并暗培养6d,可使外植体褐化率降至13.4％,卡那霉素抗性芽诱导率提高至24.3％.卡那霉素抗性植株叶片GUS染色与PCR扩增结果显示,ShivaA基因已转化至美味猕猴桃秦美.[结论]AS不同使用方式及其浓度对叶片GUS瞬时阳性表达率的提高具有明显影响;选择培养初期进行暗培养6～8 d或暗培养结合添加1.0～2.0 g/L DTT抗褐化剂,均可降低美味猕猴桃叶片转化芽再生过程中的褐化,提高转化效率.     

‘雪花梨’扩繁和叶片再生体系的建立

[目的]本文旨在获得高效的‘雪花梨’扩繁体系和叶片再生体系。[方法]以‘雪花梨’茎段为材料,通过调控培养基中6-苄氨基嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)的配比,统计其芽增殖率和植株高度,筛选出适宜‘雪花梨’扩繁的培养基;以‘雪花梨’叶片为材料,通过比较基础培养基种类、叶片接种方式、激素种类和浓度配比及暗培养时间对‘雪花梨’叶片再生率、愈伤发生率、平均每叶再生芽数和褐化率的影响,以获得高效的叶片再生体系。[结果]适宜‘雪花梨’扩繁的培养基为MS+1.0 mg·L~(-1)6-BA+0.3 mg·L~(-1)IBA,芽增殖率为4.1,植株高度为2.66 cm。适宜‘雪花梨’叶片再生的培养基为NN69+1.5 mg·L~(-1)TDZ(噻重氮苯基脲)+0.2 mg·L~(-1)IBA,再生率达到70.83%,平均每叶再生芽数为2.06,愈伤发生率达到100%,褐化率为0;远轴面朝下接种有利于提高叶片再生率;能使芽再生率最高的暗培养时间为21 d;缩短暗培养时间和提高细胞分裂素与生长素含量能有效防止褐化;适宜再生芽初代培养的培养基为MS+0.2 mg·L~(-1)IBA+1.0 mg·L~(-1)6-BA。[结论]本研究获得了‘雪花梨’高效扩繁和再生体系,为‘雪花梨’快繁和遗传转化研究提供了有效的理论和实践依据。     

108杨叶片再生体系的建立

[目的]研究欧美杨108离体叶片再生技术,为遗传转化研究提供科学依据。[方法]研究了外植体的消毒方法和不同激素组合对叶片再生和不定芽生根的诱导效果。[结果]茎段外植体消毒的最佳处理为：75%乙醇溶液消毒10s＋0.1%升汞消毒10min,污染率和褐化率均低,成活率较高;叶片诱导分化培养基以MS＋6-BA0.6mg/L＋NAA0.2mg/L效果最好,诱导率100%,平均不定芽诱导数为26.43个;最佳生根培养基为1/2MS＋IBA0.3mg/L或1/2MS＋IAA0.3mg/L,生根率可达100%,生根数分别为4.83条和5.20条。[结论]以108杨叶片为外植体,建立了108杨的高效再生体系。     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。     

蝴蝶兰叶片诱导类原球茎初探

以蝴蝶兰杂交品种H807无菌苗的叶片为材料,研究了防褐化物质(柠檬酸、抗坏血酸及活性炭)和细胞分裂素(6-BA与TDZ)对类原球茎诱导的影响。结果表明:在添加70mg/L抗坏血酸的培养基中,叶片褐化级别仅为1级,防褐化效果最佳;3mg/L的TDZ对蝴蝶兰叶片诱导类原球茎的诱导率最高,为75.0%。在以1/2MS附加70 mg/L抗坏血酸的基础上,激素组合TDZ3mg/L+NAA 1mg/L对蝴蝶兰H807类原球茎的诱导效果最佳。     

地被菊雨花勋章再生和遗传转化体系的建立

以匍匐型地被菊雨花勋章叶片为外植体,建立了其高频再生体系及根癌农杆菌介导的稳定遗传转化体系.结果表明,不同激素配比对叶片离体再生影响很大,以MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 NAA的诱导率最高,达91.1%;分化前期一定时间的暗培养可防止愈伤组织褐变,提高再生率.预培养3 d,侵染10 min,共培养3 d,延迟培养3 d为最优转化体系;乙酰丁香酮导致外植体褐化加速,不利于转化.叶片对潮霉素十分敏感,叶盘再生筛选以6～8 mg·L-1为宜,生根筛选以7 mg·L-1为宜.羧苄青霉素抑菌质量浓度以250～350 mg·L-1为宜.获得的抗性芽部分株系经PCR检测初步证实外源基因已转入植物基因组DNA中.     

兰花种子的原球茎诱导及其生长分化研究

[目的]从培养基方面优化兰花快速繁殖的技术体系。[方法]将石斛兰和秋花独蒜兰的干种子培养于MS、B5、KC液体培养基上,诱导原球茎形成,再将原球茎培养于MS、KC及B5固体培养基中,研究原球茎分化苗在不同培养基上的生长发育情况。[结果]石斛兰和秋花独蒜兰种子在B5液体培养基中诱导产生的原球茎最多,萌发率分别为3.1%、7.3%。秋花独蒜兰原球茎在KC固体培养基上的成活率最高,为71.9%,且幼苗生长发育状况最好,原球茎直径为(5.8±0.3)mm;石斛兰原球茎在B5固体培养基上的成活率最高,为65.0%,在KC固体培养基上的生长发育状况最好,原球茎直径为(3.8±0.6)mm。[结论]根据不同的组培快繁目标,可在兰花的不同生长发育阶段选用合适的培养基。     

大花蕙兰原球茎诱导培养影响因素及褐化防治的研究

[目的]研究大花蕙兰茎尖外植体原球茎诱导及增殖培养、褐化污染的影响因素。[方法]以大花蕙兰茎尖作为外植体,研究无菌系建立、诱导培养的灭菌方法与褐化防治、原球茎诱导培养初始培养基的筛选、原球茎增殖培养的影响因素。[结果]结果表明:解决茎尖内生菌污染及褐化严重的问题,两段式灭菌(75%酒精30 s+0.1%升汞10 min+剥去幼叶+0.05%升汞5 min)优于单一式的灭菌;原球茎诱导培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;原球茎增殖培养基为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭+10%马铃薯。[结论]该研究可为大花蕙兰的茎尖快速繁殖及工厂化生产提供技术依据。     

变异冬红果无菌体系的建立

[目的]建立变异冬红果初代培养无菌体系。[方法]以变异冬红果茎段为外植体,采用3种不同的消毒方法,通过统计污染率、褐化死亡率和成活率,比较变异冬红果茎段较适宜的消毒方法。[结果]用0.05%氯化汞消毒的最佳方式为氯化汞消毒20 min,污染率为17.78%,褐化死亡率为11.11%,成活率为71.11%;用0.1%氯化汞消毒的最佳方式为氯化汞消毒8 min,污染率为22.22%,褐化死亡率为20.00%,成活率为50.00%;用75%乙醇结合0.1%氯化汞消毒的最佳方式为75%乙醇30 s结合0.1%氯化汞10 min进行消毒,污染率为5.56%,褐化死亡率为55.56%,成活率为38.89%。[结论]变异冬红果茎段最佳的消毒方式为0.05%氯化汞消毒20 min,污染率为17.78%,褐化死亡率为11.11%,成活率为71.11%。     

进境韩国兰花细菌性褐腐病菌的分离与鉴定

[目的]鉴定进境韩国兰花细菌性褐腐病菌。[方法]从韩国进境的大花蕙兰植株病变叶片中分离到细菌菌株,并通过形态鉴定、培养特征、生理生化及16S rDNA序列分析和致病性测定对其进行了鉴定。[结果]确认该病菌为兰花细菌性褐腐病菌(Erwinia cypripe-dii),这是我国首次从进境兰花中检出该病害。[结论]为我国兰花细菌性褐腐病菌的预防及控制奠定了基础。     

蝴蝶兰原球茎诱导因素初探

[目的]探讨不同培养基配方诱导蝴蝶兰原球茎的效果及其诱导因素。[方法]以蝴蝶兰(f001和f006)试管苗根尖和叶为外植体,以MS和KC为基本培养基,分别添加不同浓度的6-BA、NAA和活性炭,各设置16个处理组进行原球茎诱导,研究其对诱导蝴蝶兰原球茎效果的影响。[结果]在KC+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+AC 0.3%的培养基中,蝴蝶兰f006根段原球茎状体的诱导率可达20%;f001根段的诱导培养基配方采用KC+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.2%,其原球茎的诱导率达17%,f001叶片的诱导培养基配方采用KC+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.1%,其原球茎的诱导率达10%。[结论]该研究中所用的6-BA和NAA激素和活性炭浓度在MS和KC培养基上对蝴蝶兰原球茎的诱导影响均不显著;不同外植体在不同培养基中其适宜的外源激素浓度与组合也不同。     

蝴蝶兰繁殖技术研究进展对其规模化发展的影响

[目的]探讨蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)繁殖技术研究进展对其规模化发展的影响。[方法]提取了当前蝴蝶兰繁殖技术的3个主要渠道,并从繁殖技术的难易、成功率等方面进行对比。[结果]种子胚培养、丛生芽诱导途径和原球茎诱导分化途径是实现蝴蝶兰工厂化生产的3个主要渠道,其繁殖技术方面还存在一定的瓶颈,如丛生芽发生增殖技术的重现性和稳定性及原球茎诱导稳定性不足等。虽然胚培养技术较成熟,但有报道称胚培养所得的后代表现参差不齐,亲代优良性状的遗传稳定性不足,加之组织培养过程中褐化问题不能够得到有效控制等因素,使我国蝴蝶兰工厂化生产的道路变得较曲折。[结论]欲实现蝴蝶兰的规模化发展,其繁殖技术还存在一定的瓶颈。     

不同培养条件对铁皮石斛原球茎增殖的影响

[目的]为了找到适合原球茎增殖的培养条件,为工厂化育苗提供技术支撑。[方法]以铁皮石斛茎段诱导出的原球茎为实验材料,研究了不同基本培养基、不同碳源、不同浓度的脱落酸(ABA)和培养方式对其增殖的影响。[结果]在5种培养基中,原球茎增殖倍数均呈上升的趋势,其中改良MS的增殖倍数明显高于其他培养基;在低浓度的条件下,随ABA浓度的增加,原球茎的增殖速度加快,当浓度为0.5 mg/L时,增殖最大;蔗糖为碳源时原球茎增殖的效果比葡萄糖、果糖好;固体培养和液体振荡培养时原球茎增殖倍数最高。[结论]在改良MS中加入30 mg/L蔗糖和0.5 mg/L ABA,进行固体培养或液体振荡培养,铁皮石斛原球茎增殖的效果好。     

蝴蝶兰快速繁殖技术的研究

[目的]对蝴蝶兰种子诱导原球茎和芽苗再生的条件进行研究。[方法]建立蝴蝶兰种子无菌播种高效萌发体系,以及原球茎诱导和芽苗再生的培养体系,对其各生长阶段的培养基以及所添加的激素组合及浓度进行选择。[结果]对种子萌发来说,选择授粉后120d未开裂的蝴蝶兰果荚内的种子播种为宜;最适培养基pH值为5．2～5．6。蝴蝶兰种子萌发最适宜的培养基为：花宝1号（300倍稀释）＋3mg／L6-BA4-0．1mg／LNAA＋20g／L蔗糖＋2g／L蛋白胨＋0．2％活性炭＋6g／L琼脂;在此条件下,蝴蝶兰的萌发率最高达65％。培养基中添加活性炭能有效防止蝴蝶兰芽苗的褐化现象．添加蛋白胨能促进蝴蝶兰种子萌发和幼苗的生长。[结论]该方法研究了蝴蝶兰种子诱导原球茎和芽苗再生的培养条件,为蝴蝶兰的种质栽培提供了理论依据。     

大花蕙兰再生体系建立的研究

[目的]研究并建立大花蕙兰再生体系。[方法]用75%酒精和0.1%升汞进行表面灭菌,以MS为基本培养基,采用L9(33)正交试验设计进行类原球茎增殖的优选,以继代培养40 d后的增殖系数及幼苗分化率为考察指标。[结果]在大花蕙兰离体再生过程中,侧芽是最容易启动的外植体;MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 0.1 g/L是类原球茎诱导的最佳培养基;1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是类原球茎增殖和幼苗分化的最适宜培养基;芽分化后,待长至2~3 cm时,小心切下接入1/2 MS+NAA 1.0 mg/L+GA31.0 mg/L+香蕉泥150 g/L培养基中生根壮苗效果最好。[结论]为规模化生产提供依据。     

速冻苹果块可食性涂膜技术研究

[目的]获得最适合速冻果蔬的涂膜液。[方法]配制不同浓度的壳聚糖、甘露聚糖和明胶的涂膜溶液,考察在不同解冻时间时不同涂膜液对速冻苹果切块失水率以及褐变程度的影响。[结果]3种不同浓度的涂膜液中,1.5%的壳聚糖涂膜液、1.7%的明胶涂膜液和1.0%的甘露聚糖涂膜液可较好地降低速冻苹果切块的失水率和褐变程度。[结论]综合比较,1.5%的壳聚糖涂膜液减少速冻果蔬汁液流失和降低褐变效果最好。     

有机添加物对大花蕙兰原球茎及幼苗生长发育的影响

[目的]探讨有机添加物对大花蕙兰原球茎及其再生幼苗生长发育的影响。[方法]以大花蕙兰茎尖诱导的原球茎为材料,探讨不同有机添加物对原球茎及其分化幼苗生长发育的影响。[结果]结果表明,单独添加6种有机物时,0．2g/L水解酪蛋白对原球茎增殖的效果最佳,增殖系数迭13．10,其次分别为椰子汁、蛋白胨、土豆泥、香蕉泥、番茄汁;添加混合有机物时,50．0ml／L香蕉泥与50．0ml／L土豆泥混合物的增殖效果最佳,增殖系数这16．61;100．0ml／L椰子汁对原球茎分化的效果最佳,原球茎分化芽数达11．37个／g,蛋白胨、香蕉泥,土豆泥、水解酪蛋白及番茄汁对原球茎分化具有抑制作用;添加50．0ml／L香蕉泥、2．0g/L蛋白胨与50．0ml／L土豆泥混合物的培养基更适宜大花蕙兰幼苗生长发育。[结论]该研究结果为提高大花蕙兰种苗大规模工厂化生产效率提供技术参考。     

油菜子叶及下胚轴对潮霉素敏感性研究

[目的]为油菜潮霉素抗性基因的遗传转化提供依据。[方法]以油菜品种沪油19号、苏州青、五月慢的子叶和下胚轴为外植体,研究不同浓度潮霉素处理对其褐化率、出愈率的影响。[结果]潮霉素浓度为3 mg/L时,五月慢、沪油和苏州青的褐化率分别为87.6%、30.7%、40.1%;褐化的临界浓度均为6 mg/L。苏州青下胚轴对潮霉素的耐受性较强,其褐化的临界浓度高于沪油19号和五月慢。潮霉素浓度为6 mg/L时,沪油19号、苏州青、五月慢子叶的出愈率分别为3.7%、2.3%、0,下胚轴的出愈率分别为5.1%、8.1%、2.2%。[结论]以子叶为外植体时,3个品种适宜的潮霉素筛选浓度为6 mg/L;以下胚轴为外植体时,沪油19号和五月慢适宜的潮霉素筛选浓度为6 mg/L,苏州青为9 mg/L。