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aFGF植物表达载体构建及转化紫花苜蓿的初步研究 总被引:3,自引:2,他引:1
主要将aFGF基因按照植物偏爱的密码子进行基因优化,同时加上信号肽、6-组氨酸标签及凝血酶切割因子,合成全基因,再将基因插入到改造的TΩ4AB质粒中,将aFGF基因和质粒上的增强子、启动子、Ω序列及ployA加尾序列双酶切,命名为TΩ4AB-aF,将TΩ4AB-aF插入到pBI121载体中命名为pBI121-TΩ4AB-aF。利用三亲融合法将pBI121-TΩ4AB-aF转入到农杆菌菌株LBA4404中,转化苜蓿。转基因苗用卡那霉素进行筛选;并对抗性苗进行PCR、RT-PCR、Western Blot检测。结果表明,aFGF在苜蓿中得到表达。为苜蓿作为植物生物反应器奠定理论基础。 相似文献
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目的建立KGF-2单克隆抗体间接ELISA的筛选方法 ,制备KGF-2单克隆抗体.方法以KGF-2为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清.通过棋盘滴定方法确定间接ELISA的抗原包被浓度及一抗、二抗最佳工作浓度;利用建立特异性好的间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞株.结果通过棋盘滴定最终确定了500μg/L的抗原包被浓度、1∶1 000的一抗血清稀释倍数及1∶2 000的二抗血清稀释倍数;筛选到两株可稳定分泌抗体、效价较高的杂交瘤细胞株.结论该研究建立了灵敏度高、特异性好的间接ELISA筛选体系,可用于KGF-2单克隆抗体的制备及检测. 相似文献
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解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的研究进展 总被引:8,自引:0,他引:8
近年对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的研究与探索越来越多,由于其自身具有广泛地抑制真菌与细菌的能力,因而成为具有生物农药开发潜力的微生物。文章对近几年关于解淀粉芽孢杆菌的新发现与新应用、基因功能与分子研究方法的探索、发酵条件与培养基配方的研究进行了总结。 相似文献
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设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,高拷贝基因比低拷贝高2~8倍,表达活性高2~4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,相对分子质量为40 000左右,低糖基化,均为分泌表达。West-ern blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0,30℃,1.5%甲醇诱导浓度诱导72h上清的目的蛋白表达最好。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定。本研究为中试工艺研究奠定了基础。 相似文献
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毕赤酵母表达铜锌超氧化物歧化酶中试工艺研究 总被引:1,自引:0,他引:1
正交设计优化铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母在摇瓶及30L发酵罐的诱导表达条件,用两步层析法纯化表达的目的蛋白,在不同温度下进行原液稳定性试验。用考马斯亮蓝检测蛋白含量,活性检测试剂盒检测目的蛋白活性。纯化后原液参照中华人民共和国药典三部2005版进行检测,用SDS-PAGE、HPLC检测纯度,免疫印迹法检测rhCu,Zn-SOD特异性,等点聚焦测定该酶等电点,地高辛法检测残余DNA含量,酶联免疫法测定残余蛋白含量。结果显示正交试验的大罐高密度发酵最适条件比摇瓶的最适条所获得的目的蛋白活性高8倍,纯化后,HPLC纯度为99.7%,原液比活性大于6.0×103 U/mg,各项检测指标达到生物制品检定标准。该酶在45、65、85、100℃的半衰期分别为240、120、30、15。具有良好的酶稳定性。本研究建立了发酵、纯化的中试工艺,获得高表达、高纯度及高比活的铜锌超氧化物歧化酶,为规模化生产奠定了基础。 相似文献
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温郁金RAPD-PCR反应体系建立及条件优化 总被引:1,自引:0,他引:1
在提取纯化温郁金DNA的基础上,利用PCR扩增技术,对Mg2 、dNTP、模板DTA、引物、Taq聚合酶等反应条件进行优化,建立温郁金基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系.结果表明:最佳条件是总体积为25μL,其中Mg2 (25mM)2μL,Taq 聚合酶(5 U/μL)0.3μL,引物浓度(20μM)1.0μL,模板DNA(5 ng/μL)1.0μL,dNTP(2.5 mM)2.0μL,10×PCRbuffer 2.5μL;PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性35 s,36℃退火1min,72℃复性1.5 min,共42个循环;最后72℃延伸10 min,该研究得出的体系是温郁金RAPD-PCR的最适宜反应体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带较清晰、稳定等特点,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础. 相似文献