慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠

【目的】用慢病毒在体内感染精原干细胞,建立转基因动物生产技术平台。【方法】用三质粒慢病毒载体系统转染293T细胞包装慢病毒,转染后裂解细胞,收集携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒。将慢病毒液注射到小鼠曲细精管,获得F0代小鼠,制备小鼠睾丸组织切片,进行免疫双荧光检测。将F0代小鼠与野生型母鼠交配,获得F1代小鼠,PCR检测F1代是否为转基因小鼠。【结果】通过裂解细胞的方法成功制得慢病毒,将其注射到小鼠曲细精管,获得了10只F0代小鼠,经免疫双荧光检测,发现慢病毒可在活体上感染精原干细胞。8只F0代小鼠与野生型母鼠交配后共获得了41只F1代小鼠,经PCR检测,21只携带慢病毒基因片段,转基成功率为51.22%,表明慢病毒介导的基因改造是可遗传的。【结论】建立了一种操作简单、花费少、易于实施的慢病毒活体介导精原干细胞生产转基因小鼠的技术体系,该技术也可以推广到其他动物上,对于加速功能基因鉴定、疾病模型构建和家畜转基因育种等领域的研究有促进作用。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

慢病毒法生产转基因鸡的初步研究(英文)

[目的]探索利用慢病毒生产转基因鸡的适宜方法。[方法]以增强型绿色荧光蛋白为报告基因构建慢病毒载体,包装病毒后感染鸡早期受精卵,并检测不同注射操作和不同接种滴度对鸡胚存活率的影响,同时对接种病毒鸡胚的GFP表达情况进行检测。[结果]采用105、106和107IU/ml的慢病毒滴度,鸡胚孵化率分别为87%、72%和66.7%。以雏鸡血液基因组为模板PCR鉴定转基因阳性率为45.5%;冰冻切片检测技术发现GFP基因在鸡体内不同组织的表达强度差异显著,免疫系统内表达最强,生殖系统和肌肉组织中GFP基因无表达。[结论]试验初步筛选出较适宜的慢病毒感染滴度,该结果为研制蛋鸡生物反应器和转基因鸡抗病新品系奠定了基础。     

慢病毒介导多短发卡RNA串联载体构建与体内外抗口蹄疫效果评估

【目的】探讨应用多短发卡RNA(shRNA)串联沉默口蹄疫病毒RNA复制的可行性.【方法】针对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease,FMDV)非结构蛋白基因3B和3D保守区域设计合成3个shRNA的串联片段,并分别用3个不同序列的启动子引导,成功构建了3shRNA串联的慢病毒RNAi载体.利用慢病毒3质粒包装系统共转于293T细胞包装成慢病毒颗粒.利用包装的慢病毒处理细胞及乳鼠,并接种FMDV,观察FMDV抑制情况.【结果和结论】结果显示,慢病毒处理BHK-21获得的转基因细胞中检测shRNA表达;通过O型FMDV接种发现转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显的抑制,其中在接种后24 h病毒拷贝量仅为普通细胞的1/3;O型FMDV毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的3~5日龄乳鼠,在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活,在20 LD50滴度下存活率也提高50%.构建的慢病毒介导多shRNA串联表达抗口蹄疫载体能提高BHK-21细胞和乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力,有效地避免了5 LD50滴度内乳鼠的死亡现象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能.     

鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体构建及荧光定量PCR检测重组慢病毒滴度

构建鸡卵清蛋白启动子(OV 2.8kb)与含有eGFP基因的慢病毒表达载体,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测重组慢病毒滴度。将鸡卵清蛋白启动子基因OV连接到慢病毒载体p LVshRNA-eGFP中替换质粒上CMV promoter元件,经酶切、测序鉴定获得携带OV与eGFP融合基因的重组慢病毒质粒,用QPCR检测病毒浓度滴定。结果显示,重组慢病毒质粒p LVshRNA-OV-eGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的OV基因序列完全一致。在QPCR试验过程中,发现空白组和载体组的溶解曲线和扩增曲线较好,证明基因组抽提和QPCR过程无问题。最终测得病毒滴度约为1.6×10~7IU/m L。成功构建了携带OV与eGFP融合基因的慢病毒表达载体,为进一步研究卵清蛋白启动子基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。     

睾丸注射Mx基因生产抗病转基因鸡初探

采用脂质体转染法,将线性化pcDNA3.0-MMx质粒随机打点注射入18周龄青年公鸡睾丸内,术后观察公鸡日常活动、常规检测精子;采集转染后25、50、75 d公鸡精液,并于转染70 d后人工采精,授精于正常母鸡,产生F1后代,采用常规PCR检测技术,检测证实外源Mx基因的整合情况,探讨外源Mx基因在鸡体内稳定整合和遗传的能力。结果表明:手术法转染外源基因过程对公鸡的生殖功能未造成明显影响;PCR检测证实外源Mx基因已整合到精子基因组,且能通过体外受精传递给后代,后代PCR检测的阳性率为27.27%(6/22)。证明外源Mx基因能稳定整合到基因组上,睾丸内注射法可能是一种切实可行、易于推广的制备抗病转基因鸡的方法。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株的分离与鉴定

【目的】分离鸡传染性支气管炎病毒河南地方株,并对其进行鉴定。【方法】采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用;通过酶处理、病毒干扰试验、动物回归试验、理化试验等研究病毒的特性;利用电镜观察病毒的形态,应用RT-PCR方法扩增分离毒株的S1和N基因片段。【结果】病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚,将病毒盲传至第8代时,病毒的毒力逐渐由104.0增强到107.2;经质量分数1%胰酶处理或用磷酸酯酶C处理的病毒液能够明显凝集质量分数1%鸡红细胞,血凝滴度分别在29和27左右;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖,单独接种分离毒株的尿囊液HA滴度平均为20,先接种HN99毒株再接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为23,同时接种HN99毒株和NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为28.5,单独接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为29;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感;病毒粒子直径90~105 nm;扩增到了分离毒株S1基因片段大小为1 739 bp(含前导序列),N基因全长为1 230 bp,通过与其他IBV毒株进行系统进化分析,证明分离毒株与其他毒株的亲缘关系较远。【结论】初步证实分离的病毒为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。     

睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒生产转基因兔的研究(英文)

为探讨直接用注射器对睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒转染兔的精子细胞和卵母细胞,建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择5只成年新西兰雄兔、29只经产新西兰雌兔,每侧睾丸和卵巢内分别打点注射0.5~0.8 mg/mL质粒0.25 mL。①第3周随机取一只雄兔睾丸做冰冻切片,于荧光显微镜下观察转染情况。②(Ⅰ:1#♂×7♀、Ⅱ:2#♂×7♀、Ⅲ:3#♂×7♀、Ⅳ:4#♂×7♀)其它雄兔于第6周和第7周与3日前做过卵巢注射并超排处理的雌兔配种,最后采集新生仔兔耳组织,提取基因组DNA,经PCR和Southern杂交检测阳性率。结果显示雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,统计所得后代转基因阳性率,并进行差异分析,其中Ⅰ组后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测阳性率为93.55%和83.87%,Ⅳ后代阳性率最低,依次为80.65%和70.97%,但是各组之间差异不显著。上述实验结果表明,对睾丸和卵巢同时注射外源基因可获得较高阳性率的转基因后代,生产转基因的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。     

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。     

喷射系统工作对柴油机动力性的影响

本文从理论角度分析研究了柴油机喷射系统工作时，各种现象对柴油机动力性的影响，为实际使用提供一定的理论依据。     

高浓度低容量注干施药技术初探

树干注射是一种高选择化学施药技术.具有施药准确、药液利用率高、不污染环境的特点.本文就树干注射后药剂传导的速度、注干对树体组织的损伤、药剂的选用、注药孔数和注药量等进行了实验研究,经测试树干注药后12小时可达树顶端,24h为高峰期,树顶含量达1340.82/g.通过林间实验和组织切片光镜下观察发现细胞壁稍有加厚,其它无异常现象,对树木本身也没有发现其他的伤害,证明本方法可以大规模推广和应用.     

2种中药注射剂治疗小儿急性上呼吸道感染的成本-效果比及社会效益评价

目的 分析热毒宁注射液和痰热清注射液治疗小儿急性上呼吸道感染的成本-效果优势及社会效益。方法 回顾性调查323例急性上呼吸道感染患儿,其中使用热毒宁注射液的115例,痰热清注射液的101例,利巴韦林注射液的107例,以利巴韦林组为对照组,考察热毒宁组和痰热清组的成本-效果优势及社会效益。结果 热毒宁组和痰热清组的总有效率和不良反应发生率差异均无统计学意义（P>0.0125）,但均优于利巴韦林组（P<0.0125）;3组成本-效果比分别为1.64、1.77和0.13;相对利巴韦林组,热毒宁组和痰热清组的增量成本-效果比分别为9.75和11.96。每治愈1例次患儿,痰热清组较热毒宁组多花8.82元,平均疗程多1.4 d,每家庭每例患儿年均将多花52.92元,年均将多占8.4天次诊疗机会,全院年均将多耗264.6万元,年均将多占42万天次诊疗机会。结论 治疗小儿急性上呼吸道感染,热毒宁注射液较痰热清注射液更具成本-效果优势和社会效益。     

不同输精时间和输精间隔对岭南黄鸡受精率的影响

采用随机单位组设计方案，设计4个输精时间，5个输精间隔，研究了输精时间和输精间隔对岭南黄鸡种蛋受精率的影响，结果表明，岭南黄鸡输精间隔5天的受精率最高，输精时间与输精间隔的交互作用不明显。     

健骨注射液硬膜外腔注射治疗腰腿痛52例的疗效观察

用中草药健骨注射液行硬膜外腔注射治疗急慢性腰腿痛52例,结果症状消失与功能恢复者占40.7％,总有效率为92.3％,其疗效不亚于用普鲁卡因加强的松龙注射液,且未见有何副作用,使用无禁忌症。     

3种药物对猪附红细胞体病的疗效比较试验

用3种药物对猪附红细胞体病进行了分组治疗试验,观察比较结果表明:血平试验组(Ⅰ组)效果最好,用药2d后血检转阴并再未出现反复;而大蒜组(Ⅱ组)和四环素组(Ⅲ组)在用药后3～4d血检转阴性,但在10d的试验期内还偶有弱阳性出现,证明血平注射液对猪附红细胞体病的疗效好于其他两种药物。     

速眠新麻醉剂在山羊胚胎移植手术中的应用

【目的】筛选适合于山羊胚胎移植的速眠新静脉注射麻醉剂量。【方法】以关中奶山羊为试验动物,速眠新Ⅱ注射液为麻醉剂,研究静脉注射麻醉时,不同剂量速眠新Ⅱ注射液对不同体重组(28~35,36~45和46~55kg)山羊的麻醉效果;同时比较了速眠新Ⅱ注射液2种麻醉方法(静脉注射和肌肉注射)对山羊生理指标,心电图,麻醉山羊的诱导期、麻醉期、苏醒期,麻醉苏醒后山羊的采食、反刍及精神状况的影响。【结果】(1)山羊胚胎移植受体静脉麻醉时,山羊体重为28~35,36~45及46~55 kg时,最适宜麻醉剂量分别为0.4,0.4和0.5 mL/只。(2)与麻醉前相比,麻醉后山羊的体温升高,呼吸次数和心率均降低。(3)2种麻醉方法下,麻醉效果优、良山羊的心电图均正常,无差异。(4)速眠新Ⅱ注射液静脉注射麻醉时,山羊的诱导期、麻醉期和苏醒期均较短,在苏醒后0.5 h,92.8%和87.5%的山羊可以采食和反刍,95.3%的山羊精神状况良好;苏醒后1 h基本上全部可以恢复正常。【结论】采用静脉注射麻醉山羊进行胚胎移植手术,速眠新Ⅱ注射液用药剂量小,且安全、有效,明显优于肌肉注射。     

农杆菌与质粒DNA子房注射法在棉花转基因研究中的应用

为了研究农杆菌和质粒DNA两种子房注射法对普通棉花品种的转化效率,以8891棉花为材料,分别在三亚和常德两地进行了转化试验。结果表明：与质粒DNA注射相比,三亚地区农杆菌注射的转化效率高1.25个百分点;但农杆菌子房注射的落铃率高,获得的种子相对较少;而在不同的地点试验,常德地区的落铃率显著高于三亚地区;而质粒DNA直接注射的成铃率更高,虽然转化率相对较低,但也能获得有效的转化植株。     

基于单片机的丘陵烟区烟用保水剂注水系统设计

部分西南丘陵地区春旱发生时,烟区烟株生长量不足,烟叶品质量不高。行之有效的方式是为植烟地土壤施用烟用保水剂,从而增强土壤的蓄水保墒能力,提高灌溉水利用效率,促进烟株的生长发育。当保水剂施用于地表以下的土层后,急需为保水剂进行注水作业,但目前还没有专门的保水剂注水系统。因此,本文以AT89C51单片机为控制器,设计一套适用于丘陵烟区烟用保水剂的注水系统,整套注水系统主要由整机机架、动力组件、自动收放管机构、缠管机构、潜射式注水枪和保水剂注水作业控制系统等构成。该系统具备响应快、精度高和操作简便等特点,能解决在丘陵烟区春旱时期土壤的蓄水保墒能力差、烟株生长发育不足、丘陵烟区烟叶的品质量不高的难题,适用于丘陵烟区烟用保水剂的注水作业。     

两种新型制剂对人工诱发鸡白痢的疗效观察

为了评价头孢噻呋不同剂型、不同用法对革兰氏阴性菌所致鸡病的临床疗效。采用3日龄雏鸡人工诱发鸡白痢,接种后5小时分别对6组试验鸡给以不同剂量头孢噻呋混悬液(注射)和头孢噻呋钠冻干粉(灌服),每天一次,连用三天,同时对另3组试验鸡用硫酸粘杆菌素、氟苯尼考、氨苄西林混悬注射液作药物治疗对照。用药后15天试验结果表明:头孢噻呋治疗组的平均死亡率为8 3%,对照药物治疗组的死亡率分别为26 6%(氨苄西林混悬注射液)、10 0%(硫酸粘杆菌素)、23 3%(氟苯尼考)。头孢噻呋组的平均治愈率为87 75%,对照药物治疗组的治愈率分别为70%(氨苄西林混悬注射液)、76 6%(硫酸粘杆菌素)、63 3%(氟苯尼考)。头孢噻呋的治疗效果在死亡率、有效率和治愈率的指标比较上,均显著高于对照药物;头孢噻呋混悬液和冻干粉在同剂量水平比较上,疗效无统计学差异;两剂型高、中剂量组的疗效均高于低剂量组。