家畜GnRH免疫去势的研究进展

对家畜来说,去势有其必要性.完整公猪肉中有一种难闻的"膻味"(主要成分是雄烯酮和粪臭素);公牛、公羊性情暴躁凶悍,相互格斗,容易造成外伤感染,而且肉质嫩度差、质地粗糙、质量等级低;母牛在性成熟后18-24 d会出现周期性发情,易在牛群中引起混乱,导致无计划怀孕而影响育肥效果.     

聚乙二醇化重组人白细胞介素6的放射性标记

分别用常规氯氨T和改进的双相氯氨T法对PEG-rhIL-6进行放射性碘标记,用柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化,同时用三氯乙酸沉淀法和SDS-PAGE电泳法鉴定纯化后的标记化合物放射化学纯度,采用rhIL-6依赖细胞7TD1,用MTT比色法测定标记物的生物学活性。结果表明:1.改进的双相氯氨T法标记率为74.5%,高于常规氯氨T法的62.3%,放射性比活度分别为5.513×105和4.610×105Bq/μg。2.经柱层析法和离心超滤法对标记物分离纯化后,用三氯乙酸沉淀法测得放射化学纯度均能达到99%以上。3.用SDS-PAGE电泳法检测两种标记方法所得的标记物与非标记物的结果表明,常规氯氨T法标记物比非标记物多1条高分子量蛋白带,认为是标记过程中蛋白质受到部分损伤;改进的双相氯氨T的标记物与非标记物蛋白质条带一致,认为蛋白质标记后基本没有受到损伤。4.生物活性检测表明改进的双相氯氨T标记物与非标记物活性之间无显著差异,常规氯氨T法标记物活性略低于双相氯氨T的标记物活性。     

GnRH主动免疫对雄性大鼠垂体-睾丸轴功能的影响

本研究用GnRH并列体二聚物(GnRH-TDK)主动免疫SD雄性大鼠观察其对大鼠垂体-睾丸轴功能的影响,以探讨GnRH主动免疫去势的分子机理.24只性成熟SD雄鼠随机分为免疫组和对照组,免疫组雄鼠于12周龄时初免,8周后加免,对照组雄鼠不做任何注射.每两周采集血液放免法检测血清抗体滴度及激素含量变化.加免后4周脱颈处死所有雄鼠,收集垂体、睾丸实时荧光定量PCR分析相关生殖基因mRNA的变化.结果显示,GnRH主动免疫后12只免疫雄鼠中11只血清GnRH抗体滴度显著上升,血清LH、FSH及睾酮(T)均极显著下降到检测限附近或以下(p＜0.01),同时睾丸严重萎缩,其重量及体积下降到对照组睾丸的20％(p＜0.01),组织切片显示,曲细精管上皮组织严重受损,管内仅有少数退化的精原细胞.与对照组相比,GnRH主动免疫极显著下调雄鼠垂体GnRH受体、LH-β、FSH-β和睾丸LH受体及FSH受体mRNA表达水平(p＜0.01).由此可见,GnRH主动免疫可通过下调垂体GnRH受体、促性腺激素亚基及睾丸LH、FSH受体基因表达,影响垂体-睾丸轴的功能.     

RNA干扰及其在动物繁殖中的应用

RNA干扰(RNAi)是由短的双链RNA降解内源的同源mRNA而引发的转录后基因沉默现象。RNAi作为一种调控特定基因表达的工具,被称为基因组的免疫现象,已成为当前繁殖领域的研究热点之一。该文就RNAi的发现、RNAi的过程及其在动物繁殖中的应用等方面的研究进展作一概述。     

SD雄鼠3种不同新蛋白构型GnRH去势抗原免疫学及生物学效果对比研究

旨在对比研究SD雄鼠3种不同新蛋白构型GnRH抗原的免疫学及生物学效果。本研究新蛋白构型GnRH抗原设计采用增加GnRH拷贝数和增大抗原分子量方法。以化学合成法合成G6K-GnRH并列体(G6K-GnRH-tandem,G6KT)作为新蛋白GnRH抗原制备的基本单元。将G6KT二聚化,形成抗原Ⅰ(G6KTD),将G6KT和G6KTD分别与卵清蛋白(OVA)偶联,分别形成抗原П(G6KT-OVA)及抗原Ⅲ(G6KTD-OVA)。试验分5组:完整对照组(不做任何处理,intact control)、外科阉割去势组(surgical castrates)及3种新蛋白构型GnRH免疫组(G6KTD、G6KT-OVA及G6KTD-OVA免疫组)。将(G6KTD、G6KT-OVA、G6KTD-OVA)3种不同新蛋白构型GnRH抗原配于Specol佐剂,分别免疫SD雄鼠,6周龄时初免,腿部肌肉注射1 mL乳化抗原(含相应新构型GnRH蛋白100μg),8周后加免,注射剂量与方法同初次免疫,每试验组12只雄鼠。放免法及酶联免疫法测定血清抗体及生殖激素浓度变化,qPCR检测垂体-睾丸生殖相关基因mRNA表达变化。结果显示:1)SD雄鼠主动免疫3种不同新蛋白构型GnRH抗原后均能产生良好的抗体反应。2)G6KT-OVA及G6KTD-OVA免疫组仅初免就能诱发较高水平的抗体产生,并显著降低雄鼠血清LH、FSH、睾酮(T)及抑制素B (INHB)浓度(P<0.05);试验结束时,该两种抗原免疫组雄鼠睾丸重量及体积均降低,精子发生完全被终止,垂体GnRHR、LHβ、FSHβ及睾丸LHR、FSHR、INHα、INβA及INHβB mRNA表达显著下调(P<0.05)。3)G6KTD免疫组12只雄鼠中,9只(75%)在加免后血清LH、FSH、T及INHB浓度显著降低(P<0.05),试验结束时睾丸重量及体积均显著降低(P<0.05),精子发生受到明显抑制(P<0.05)。综上表明:新蛋白构型G6KT-OVA和G6KTD-OVA具有极强的免疫原性,初次免疫就能达到抑制生殖激素分泌的目的,在作为单剂量GnRH疫苗方面具良好的开发前景;同时G6KTD也具有较强的免疫原性,可不与载体蛋白偶联单独作为GnRH去势抗原,继而避开GnRH分子与载体蛋白偶联所面临的GnRH抗原损失严重及与载体蛋白偶联的后续纯化等问题。本研究结果为研发高效GnRH去势疫苗及其大规模应用提供了理论参考。     

16种四川道地药材对鸡胚成纤维细胞生长的影响

该实验通过MTT法观察丹参、川木香、菊花、川郁金、川黄柏、川佛手、川牛膝、川莪术、川明参、川续断、川麦冬、川白芷、川芎、杜仲、川党参和乌梅等16种四川产道地药材对体外培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全体积质量分数,并观察各种中药提取液对CEF增殖的影响.结果表明以上各种药材的最大安全体积质量分数:川黄柏为3.907mg/L,丹参、川木香、川续断和川党参均为7.813mg/L,菊花为15.625mg/L,杜仲、川佛手、川麦冬、川芎和白芷均为31.25mg/L,川郁金、杜仲、川乌梅和川牛膝均为62.5mg/L,川明参为1 000mg/L.当川郁金在1.954～31.25mg/L,川牛膝在3.907～31.25mg/L,川明参在1.954～500mg/L,川续断在1.954～3.907mg/L,川麦冬在1.954～15.625mg/L,杜仲在1.954～31.25mg/L的体积质量分数范围内可显著促进细胞生长.     

睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒生产转基因兔的研究(英文)

为探讨直接用注射器对睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒转染兔的精子细胞和卵母细胞,建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择5只成年新西兰雄兔、29只经产新西兰雌兔,每侧睾丸和卵巢内分别打点注射0.5~0.8 mg/mL质粒0.25 mL。①第3周随机取一只雄兔睾丸做冰冻切片,于荧光显微镜下观察转染情况。②(Ⅰ:1#♂×7♀、Ⅱ:2#♂×7♀、Ⅲ:3#♂×7♀、Ⅳ:4#♂×7♀)其它雄兔于第6周和第7周与3日前做过卵巢注射并超排处理的雌兔配种,最后采集新生仔兔耳组织,提取基因组DNA,经PCR和Southern杂交检测阳性率。结果显示雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,统计所得后代转基因阳性率,并进行差异分析,其中Ⅰ组后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测阳性率为93.55%和83.87%,Ⅳ后代阳性率最低,依次为80.65%和70.97%,但是各组之间差异不显著。上述实验结果表明,对睾丸和卵巢同时注射外源基因可获得较高阳性率的转基因后代,生产转基因的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。     

抑制素免疫在家畜繁殖中的应用

抑制素是一种主要由动物性腺分泌的糖蛋白激素,对促卵泡素的分泌具有负反馈调节物作用。用抑制素主动或被动免疫可以提高家畜的排卵率和产仔数。本文就抑制素、抑制素免疫的机制及其在家畜繁殖中的应用等方面的研究进展做一概述。     

8种中药成分体外抗犬细小病毒的研究

本研究旨在观察8种中药成分黄芪多糖（APS）,白术多糖（RAPS）,黄芩多糖（BSPS）,金银花多糖（FLPS）,栀子苷（CS）,苦参生物碱（SFA）,黄芪皂苷（AS）和金银花黄酮（FLF）体外对犬细小病毒（CPV）感染细胞能力的影响。分别将8种中药成分通过先加中药再接病毒、病毒和中药感作后加入和先接种病毒再加中药3种加药方式加入到培养24h的F81细胞中,于病毒接种后72h用MTT法测定F81细胞活性以评价各中药成分对F81细胞抵抗犬细小病毒感染的影响。结果,在第1种加药方式下,APS、RAPS、BSPS、FLPS抗CPV作用较强;在第2种加药方式下CS的抗病毒作用最为显著;在第3种加药方式下CS、SFA抗病毒作用最为显著。结果表明,8种中药成分均能不同程度地促进F81细胞抵抗病毒感染,部分中药成分的抗病毒作用与加药方式有关且呈一定的量效关系。     

双抗体夹心ELISA检测水牛γ-干扰素方法的建立及初步应用

纯化2株针对水牛γ-干扰素的单克隆抗体,其中1株进行HRP标记作为检测抗体,另1株单抗作为捕获抗体,建立检测水牛γ-干扰素的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)。通过对封闭液、抗体稀释液等条件进行优化,经过方阵滴定试验确定捕获抗体的最佳浓度为625 ng/mL,检测抗体的工作效价为1∶100;所建立的DAS-ELISA方法检测灵敏度25 ng/mL,批内变异系数为0.52%～6.86%,批间变异系数为5.6%～7.07%。采集60头单次皮内注射结核菌素的水牛肝素钠抗凝全血,利用牛结核杆菌特异性抗原rHIS-CFP10/ESAT-6融合蛋白体外刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,用所建立的夹心ELISA检测所有样本,与皮内变态反应试验比较,结果显示,自制夹心ELISA方法检测水牛结核病的敏感性为62%,特异性为87%,符合率为75%,表明可应用于水牛结核病的检测。