盘羊杂交羊SPLUNC1融合蛋白的真核表达

为构建盘羊杂交羊SPLUNC1基因的真核表达载体并在巴斯德毕赤酵母中表达,从盘羊杂交羊口腔上颚的上皮细胞中提取总RNA,并反转录成c DNA,以该c DNA为模板采用逆转录PCR(RT-PCR)法克隆盘羊杂交羊SPLUNC1基因开放阅读框,并克隆到p PIC9K载体中,构建真核表达载体p PIC9K-SPLUNC1,再将重组质粒电转至毕赤酵母GS115中进行表达,表达产物经Ni-NTA琼脂亲和层析纯化,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western Blot)方法检测。结果显示,目的基因大小758 bp,重组表达质粒p PIC9K-SPLUNC1经双酶切、PCR及测序鉴定构建成功;表达产物经SDS-PAGE分析,可见大小为25.96 ku的目的条带,且在72 h表达量最大;纯化后经SDS-PAGE和Western Blot分析,可见大小为25.96 ku的目的条带。研究结果表明,利用真核表达系统在体外成功表达并纯化了盘羊杂交羊r SPLUNC1蛋白,为深入研究盘羊杂交羊SPLUNC1蛋白的生物学功能奠定基础。     

弓形虫GRA3基因真核表达质粒的构建与鉴定

以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质粒pVAX-GRA3转染Hela细胞,然后进行RT-PCR检测。RT-PCR结果表明,检测到了目的基因的存在,说明pVAX-GRA3成功转入Hela细胞。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

猪CCL17基因的克隆与原核和真核表达

【目的】克隆猪胸腺活化调节趋化因子CCL17基因,研究其在原核及真核系统中的表达。【方法】提取仔猪脾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增CCL17,并将其与已知序列的CCL17进行同源性比较;CCL17基因经测序验证后,将其分别克隆入表达载体pET-32a和pEGFP-C1,构建该基因的重组原核表达载体pET-CCL17和真核表达载体pEGFP-CCL17,分别进行双酶切和测序鉴定;前者在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,后者以脂质体介导法转染至猪血管内皮细胞(SUVECs),通过绿色荧光标记和Western blot检测细胞中CCL17基因的表达水平。【结果】PCR扩增得到CCL17309bp的DNA片段;重组表达质粒pET-CCL17和pEGFP-CCL17经双酶切鉴定和测序分析证明,载体构建成功。pET-CCL17经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明,目的蛋白在宿主大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达CCL17融合蛋白,分子质量约32ku,与其理论分子质量基本相符;pEGFP-CCL17转染SUVECs,经Westernblot检测,证实导入的CCL17基因得到了表达。【结论】克隆了猪的CCL17基因,利用大肠杆菌成功表达了CCL17重组蛋白,真核重组质粒在SUVECs中也得到了表达。     

犬MC4R突变体D90N真核表达载体的构建及表达

[目的]构建犬黑皮质素受体4（MC4R）突变体D90N真核表达载体,并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板,应用重叠PCR扩增MC4R突变体D90N目的基因,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N经酶切和测序鉴定;采用FuGENEHD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72.0h,提取细胞内总RNA,用RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,用WesternBlot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N重组真核表达载体,测序结果显示含有D90N突变位点。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R-D90N,重组体能在MD-CK细胞中表达。     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

柔嫩艾美耳球虫MIC4-N的真核表达

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫的MIC4-N端基因并去掉信号肽,为了表达检测和纯化的方便,设计引物时改变了3＇端的终止密码子,使MIC4-N的C末端带有c-myc和6His抗原标签。通过双酶切,使加工好的MIC4-N基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,转化JM109感受态细胞。再经EcoRⅠ与NotⅠ双酶切、菌落PCR及测序鉴定,证明目的基因与真核表达载体pPICZαA构建成功,单酶切重组表达载体、电转转入GS115酵母感受态细胞中。用含高浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母菌落,菌落PCR法鉴定转化成功的阳性菌,在BMMY培养基中摇瓶培养,并用甲醇诱导,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,蛋白分泌表达成功。     

pPIC9K-IL-2重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

根据Ovis aries interleukin(IL-2)序列设计1对引物,用PCR法扩增的目的基因进行克隆,将测序正确的IL-2基因片段和表达载体pPIC9K同时双酶切后相连,构建pPIC9K-IL-2重组表达载体.将线性化的载体pPIC9K-IL-2电转化毕赤酵母GS115,对重组酵母转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,用G418(4g/L)筛选到多拷贝菌株,进行不同条件下甲醇诱导表达.结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量约为18ku目的蛋白表达条带,本研究成功构建了高效表达重组羊IL-2毕赤酵母菌株,为新型细胞因子佐剂的研发奠定了基础.     

高表达牛气管防御素的真核重组载体的构建及其鉴定

根据GeneBank中牛TAP的序列设计了1对特异性引物,采用RT-PCR方法从牛气管组织扩增牛TAP基因,并克隆到pEASY-T3载体。测序结果表明,扩增的片段含有144 bp核苷酸,编码48个氨基酸,与已报道的bTAP有1个氨基酸不同。该基因与真核表达载体FG9重组,经过PCR,酶切和测序鉴定,筛选牛TAP基因重组真核表达载体。使用脂质体法将FG9-TAP重组质粒转染293T细胞,斑点ELISA检测结果表明,成功构建了高表达牛TAP基因的真核表达载体,为抗金黄色葡萄球菌转牛TAP基因奶牛培育研究奠定基础。     

新疆巴什拜羊ISG15基因的克隆表达及活性检测

克隆表达新疆巴什拜羊ISG15基因,并对其表达产物的活性进行检测。利用RT-PCR和RACE技术克隆了巴什拜羊ISG15基因的cDNA全长序列,将ISG15基因克隆至真核表达载体pPIC9K,经电击转化至GS115中并用甲醇进行诱导表达,用Ni2+螯合亲和层析法对表达的蛋白进行纯化,通过淋巴细胞转化试验来检测表达蛋白的活性。结果表明:克隆得到的巴什拜羊ISG15基因cDNA全长为646 bp,开放阅读框为474 bp,编码157个氨基酸。经酵母重组菌株GS115/pPIC9K-ISG15表达,SDS-PAGE结果显示表达的蛋白约为33 ku,表达的蛋白可用Ni2+螯合亲和层析方法纯化,淋巴细胞增殖试验结果显示,表达的ISG15蛋白能够显著地刺激淋巴细胞增殖(P<0.05),表明表达的蛋白具有生物学活性。     

牛生长激素BGH基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-N1-BGH的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从11月龄的牛脑垂体组织中扩增出BGH基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-BGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,结果表明,成功构建了pEGFP-N1-BGH真核表达载体。     

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

 【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用 RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法（splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR）把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染 BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。     

柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)的转录情况进行分析,同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段,将该基因连接到pGEM-T-easy载体上,经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因.用EcoRI和NotI酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上,构建了重组质粒pPIC9k-A08,转化大肠杆菌TOP10后,提取质粒,经酶切鉴定正确后用SacI将重组质粒线性化,再电转入毕赤酵母GS115菌株,G418筛选抗性重组子,经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达.RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段,是一个子孢子高表达基因.重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实,柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达.Western-blot初步分析表明,表达产物具有免疫学反应活性.     

羊口疮病毒B2L基因克隆及表达

为了获得羊口疮病毒囊膜蛋白。以羊口疮病毒基因组为模板,利用羊口疮病毒B2L基因特异性引物,进行PCR扩增,回收以及纯化PCR产物,连接到PMD18-T载体上,测序结果表明B2L基因全长1 137 bp,编码379个氨基酸。再将B2L基因克隆至p ET-30a,构建原核表达载体p ET30a-B2L。经菌液PCR、酶切鉴定以及SDS-PAGE等方法表明成功构建原核表达载体,这将为今后的单抗制备以及羊口疮病毒的疫苗研究打下基础。     

猪pGH基因真核表达载体的构建及其表达

从120日龄的长白猪脑垂体组织中扩增出pGH基因的cDNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pEGFP-N1真核表达载体上,构建pEGFP-N1-pGH重组质粒。通过PCR扩增、酶切电泳分析和测序的方法对重组DNA进行鉴定,并将其转染PK15细胞,通过荧光素酶活性检测特异性表达强度.结果表明,成功构建了pEGFP-N1-pGH真核表达载体,为转基因猪的研究奠定了基础。     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

马MxA基因真核载体表达重组质粒的构建与鉴定

从马外周血单核细胞中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,获得了MxAcDNA.扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pGEMR-T Easy栽体连接,转入大肠杆菌中筛选鉴定重组子.将质粒经酶切鉴定后.把酶切下的目的基因MxA cDNA进一步克隆到真核表达载体pCI-neo中,经PCR及序列鉴定,证实插入栽体pCI中的片段为含有目的基因的核苷酸序列.真核表达重组质粒DCI-neo MxA cDNA的构建成功,为进一步研究马MxA蛋白的抗病毒作用奠定了基础.     

MBP-mCTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

为了构建鼠的CTCF与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并进行原核诱导表达及鉴定,以pMXs-3Flag-m CTCF为模板,PCR扩增得到mCTCF序列,目的基因片段EcoRI,SalI双酶切后连接到同样双酶切的pMal-C2G载体上,测序鉴定。将测序正确的质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE分离检测蛋白表达效果。经菌液PCR、测序鉴定、双酶切鉴定证明,得到的重组质粒pMal-C2G-mCTCF构建成功,且成功诱导出了MBP-mCTCF融合蛋白,最佳诱导条件为:10×10~(-4) mol/L IPTG浓度在37℃诱导6 h。