牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒的构建及鉴定

PCR扩增牛源犬新孢子虫NcAMA1基因,克隆至pMD18-T simple载体;将鉴定正确的NcAMA1基因亚克隆至pCR259腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1;依次转化HighQ-1Transpose-AdTM294和HighQ-1TM感受态细胞,构建NcAMA1基因重组腺病毒表达质粒T294-NcAMA1;PacⅠ酶线性化后,脂质体介导转染至QBI-HEK293细胞,包装Ad5-NcAMA1重组腺病毒。结果表明,获得Ad5-NcAMA1重组腺病毒滴度为5.6×109 TCID50/mL;经PCR检测到重组腺病毒NcAMA1基因;经IFAT和Western blot检测NcAMA1基因在QBIHEK293细胞中获得表达,表达蛋白相对分子质量为68 000,具有较好的反应原性。本试验成功构建了Ad5-NcAMA1重组腺病毒,为牛源犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定基础。     

表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础.     

基孔肯雅病毒E1基因重组腺病毒的构建、鉴定及稳定性

构建表达基孔肯雅病毒E1蛋白的重组腺病毒,鉴定该重组腺病毒,并对该重组腺病毒的稳定性进行研究。本研究通过构建重组腺病毒穿梭质粒Ad5-EGFP-CHIKV-E1,将质粒Ad5-EGFP-CHIKV-E1与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞获得重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1,并通过Western blot与PCR方法鉴定E1基因表达的稳定性。PCR鉴定结果表明重组腺病毒可扩增1323bp大小的条带;经Western blot鉴定重组腺病毒可表达大小为52 000的E1蛋白。结果表明,重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1可以成功表达基孔肯雅病毒E1基因;提取第0,2,4,6,8,10,12,14,16代重组腺病毒基因组,经PCR鉴定证实重组腺病毒在16代内稳定性良好。成功构建出表达基孔肯雅病毒E1基因的重组腺病毒rAd5-EGFP-CHIKV-E1,该病毒可以稳定表达,为研发基孔肯雅病毒疫苗奠定基础。     

表达产肠毒素性大肠埃希菌STa-K99融合蛋白重组腺病毒的免疫学特性研究

为研究表达产肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)耐热性肠毒素STa与粘附素K99融合蛋白重组腺病毒rAd.STa-K99的免疫学特性,本实验将rAd.STa-K99经肌肉注射免疫小鼠,采用ELISA法分别检测了特异性IgG、SIgA、脾脏淋巴细胞增殖活性水平及CD4+、CD8+T淋巴细胞分型比值;并通过攻毒保护试验对其免疫效果进行评价.结果表明,免疫后小鼠特异性IgG、SIgA及脾脏淋巴细胞增殖活性水平显著升高;CD4+/CD8+值显著增大;动物攻毒保护率达到70％.结果表明rAd.STa-K99可以刺激小鼠机体产生较高水平的体液免疫、特异性细胞免疫和肠道粘膜免疫反应,并对小鼠提供有效保护.本实验为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒疫苗奠定了基础.     

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3 895和1 752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60...     

大肠杆菌耐热性肠毒素ST Ⅰ突变体与黏附素K99融合基因的构建及其表达

采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别.     

表达非洲猪瘟病毒P72蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

本研究旨在构建能够表达非洲猪瘟病毒(ASFV)P72蛋白的缺陷型重组腺病毒。参考ASFV China-SY18株的基因序列,合成B646L基因。先将合成的B646L基因通过TOPO连接克隆到过渡载体pENTR/D-TOPO中;再将插入B646L基因的过渡载体pENTR/D-TOPO-ASFV-P72与pAd/CMV/V5-DEST腺病毒骨架载体进行重组,得到pAd-ASFV-P72重组质粒;重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,连续传代后获得重组腺病毒。结果表明,获得的Ad5-ASFV-P72重组腺病毒的滴度为2.53×10~9 IFU·mL~(-1);经免疫荧光方法及Western blot鉴定ASFV-P72蛋白在Vero细胞中成功表达,且能够与ASFV标准阳性血清发生特异性反应。本研究成功获得能够表达ASFV P72蛋白的重组腺病毒Ad5-ASFV-P72,不仅为ASFV多基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了一定基础,还为ASFV相关血清学诊断方法的建立提供了安全有效的抗原。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列(登录号:CP002525.1)设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用KpnⅠ和XhoⅠ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR~259中,构建PCR~259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR~259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法(IFTA)检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列(登录号:CP002525.1)同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR~259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR~259-ENO构建成功。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验(IFTA)鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组:重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4~+和CD8~+含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10~9 PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG_1、IgG_(2a)抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组(P0.05;P0.01)。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。