猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

坏死梭杆菌亚单位疫苗候选抗原蛋白的筛选、表达及免疫原性分析

试验旨在筛选坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum,Fn)外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)中的候选抗原蛋白,为Fn的亚单位疫苗研究奠定基础。采用Uniprot对Fn Omp序列进行预测,基于预测结果筛选拟表达蛋白,并根据GenBank中登录的Fn Omp相应基因序列设计特异性引物,以QL03株为模板进行PCR扩增、原核表达,以及SDS-PAGE和Western blotting分析,并通过血清杀菌试验和小鼠免疫攻毒保护试验,鉴定重组蛋白的免疫原性,筛选最佳候选蛋白。结果显示,预测得到121个蛋白,顺次命名为1-Fn～121-Fn,根据预测结果筛选出8-Fn、11-Fn、41-Fn、95-Fn和102-Fn 5个候选蛋白,其PCR扩增产物大小分别为672、1 164、570、1 059、729bp。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,除8-Fn未表达外,其余4个蛋白均成功表达,大小分别为60、39、59、44ku,命名为P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn,均能与Fn阳性血清反应。血清杀菌试验结果显示,4个重组蛋白均有一定杀菌效果,其中抗P102-Fn血清的杀菌效果最佳,杀菌率可达40.49%。小鼠免疫保护试验结果显示,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn对小鼠均具有一定的保护效果,其中P102-Fn保护效率最高,达60%。结果表明,P11-Fn、P41-Fn、P95-Fn和P102-Fn均具有良好的免疫原性,其中P102-Fn的免疫原性及诱导机体产生保护免疫反应能力最佳,最有望成为Fn亚单位疫苗的候选蛋白。     

胶体金免疫层析技术在猪病毒病诊断中的应用与研究进展

胶体金技术是一种常见的标记技术,胶体金免疫层析试纸条因具有简便、快速、廉价、易操作、安全、稳定、不需特殊仪器、肉眼即可判断等优点,在动物疫病检测,特别是基层兽医人员以及大批量检测和大面积普查等方面得到了广泛应用,显示出了巨大的发展潜力和广阔的应用前景。本文就胶体金试纸条在猪病快速诊断上的应用现状及发展前景作一简要综述,为我国猪病毒病的诊断与预防控制提供参考,同时对胶体金技术与几种常见检测技术的性能进行了比较,剖析了胶体金技术的优势及发展瓶颈,并对其发展方向进行了展望。     

四川省部分地区奶牛寄生虫病流行调查及与中国奶牛寄生虫名录的比较

在四川省成都市、眉山市、西昌市的12个奶牛场和5个奶牛养殖小区,采用临床调查、奶牛粪便检测等方法进行了奶牛寄生虫病流行调查。结果表明,螨虫病和前后盘吸虫病在各奶牛场和小区均有感染,比例为100%;片形吸虫病的虫卵阳性场有10个,比例为83.3%,牛群的感染范围为4.9%~10.53%,EPG值范围为78~123;线虫病的虫卵阳性场有11个,比例为91.7%,牛群的感染范围为5.3%~44.4%,EPG值范围为60~400;奶犊牛球虫病卵囊阳性场有12个,比例为100%,牛群的感染范围为12.3%~75.0%,OPG值为62~4 186。此次调查为进一步了解我国奶牛的寄生虫感染情况、收集和整理奶牛的寄生虫相关报告提供了颇有价值的参考。     

猪瘟病毒E2基因密码子偏爱性分析

本试验旨在阐明猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)囊膜结构(糖)蛋白E2基因的密码子使用规律,以期为选择高效的表达系统、探索基因功能提供理论依据.本研究运用EMBOSS在线分析软件的CHIPS和CUSP程序对CSFV E2基因进行密码子偏爱性分析.结果显示CSFV E2基因的CAI值为0.703,ENC值为53.161,表明E2在密码子使用上存在较明显的偏爱性,且第3位核苷酸尤其偏爱G或C;从与CSFV E2基因密码子使用频率比值上看,使用频率差异较大的在大肠杆菌有33个、酵母有25个、人有25个;CSFV E2基因共有34个稀有密码子,且还有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现.本试验结果表明酵母等真核生物与CSFV E2基因密码子偏爱性较为接近, 可作为其体外表达系统.     

宏基因组法研究不同堆肥处理下猪粪微生物动态结构特征

试验旨在应用宏基因组测序技术探究两种堆肥处理方式下猪粪中微生物的结构组成与分布特征。试验采集同一粪池中的新鲜猪粪，随机分成添加有效微生物（EM）菌的F组和未添加EM菌的K组，每组粪堆各1堆，堆成圆锥形粪堆，粪堆高1.2 m，底部直径2 m；采集堆肥第0、7、14和21天的粪便样本并提取粪便总DNA，运用宏基因组高通量测序技术，比较F组和K组的微生物多样性（组成及结构）差异，并对功能基因进行注释。结果表明，猪粪便中的细菌共测序获得1 083 607个有效开放阅读框（ORFs）；共鉴定出147个门、118个纲、258个目、593个科、2 343个属和13 193个种；在门水平上，相对丰度前十的细菌界优势菌门有：变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、绿弯菌门（Chloroflexi）、柔壁菌门（Tenericutes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、螺旋体门（Spirochaetes）和酸杆菌门（Acidobacteria）；在属水平上，两组平均丰度值排名前三十五的属分别属于变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和疣微菌门；通过KEGG功能预测分析，新陈代谢通路是最丰富的，氨基酸代谢通路和碳水化合物代谢通路是包含功能基因数量最多的二级通路。两组的菌群结构多样性差异表明添加EM菌后会促进堆肥前期的菌群变化。     

犊牛腹泻病流行情况调查与解决措施

通过对5个牛场和1个散养区共930头犊牛进行调查,结果发现,犊牛腹泻发病率为30%～72%,平均为49.5%;死亡率为0.5%～2.0%,平均为1.4%。犊牛腹泻病有明显的季节性,冬季和春季多发。病因主要为消化不良、细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、气候变化、饲喂霉变饲料等。建议采取加强牛场环境卫生管理、改善饲养环境、调整饲料结构、定期驱虫及加强冬春季预防工作等应对措施。     

肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)及E_2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFVE_2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E_2基因的分子特性。结果显示,扩增的E_2基因大小为1 125bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E_2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E_2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E_2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E_2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E_2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E_2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。