潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。     

潜伏期马立克氏病病鸡血清I型病毒L—meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒（MDV）鸡淋巴组织中提取基因组DNA，采用梯度PCR的方法获得MDV的L—meq、meq基因，将其插入pMD18-T克隆载体，经测序并进行了序列分析。结果表明，L—meq、meq基因同源性很高，L—meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L—meq基因消失的原因，试验对L—meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明，L—meq基因中含有9个PRR（proline—rich—reapts）区域，meq中含有6个PRR区域，从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关。该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因，同时也意味着L—meq基因对于潜伏期的维持是必要的。     

马立克氏病病毒致瘤相关基因meq在不同病变组织中的变化

以MSB-1肿瘤细胞建立的马立克氏病为病理模型,利用PCR技术扩增不同病变组织中的meq基因,构建meq基因重组阳性质粒,测定和比较它们的核苷酸和氨基酸序列。结果显示,与L-meq（1 200 bp）和标准株GA的meq（1 020 bp）比较,MSB-1细胞和脾脏肿瘤组织的meq基因（1 197 bp）、羽髓meq基因（1 017 bp）分别相应缺失3个碱基（CCA）;MSB-1细胞和脾脏肿瘤组织的meq基因具有与L-meq相同的180 bp插入序列;氨基酸序列也发生相应变化。结果表明,meq基因在不同病变组织中的核苷酸序列发生了变化,这种变化可能与马立克氏病病毒的致瘤机制有关。     

马立克氏病病毒L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。     

一株鸡马立克氏病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

吉林省某地区鸡马立克氏病（MD）疫苗免疫鸡群暴发MD,从发病鸡羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞生长的马立克氏病毒（MDV）。该毒株感染无特定病原体（SPF）鸡可引起典型的MD临床症状：对非免疫鸡和火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗免疫鸡的致病率分别为76％和72％,二者无显著差异,表明HVT疫苗对该毒株不能提供有效保护。通过对该毒株病毒基因组中132bp重复序列、meq基因的核苷酸及推导的氨基酸序列分析,发现该毒株的132bp重复序列的拷贝数、meq基因的变异符合高毒力MDV毒株的特点。     

河南土鸡群马立克病病毒流行毒株的分离鉴定及分子进化分析

本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)流行毒株,了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病(MD)的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132-bp重复序列基因的特异性引物,应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊,并通过鸡胚成纤维细胞(CEF)盲传培养和间接免疫荧光试验(IFA)分离鉴定了3个流行毒株,分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示,3个MDV分离株均为血清1型(MDV-1)毒株,未发生禽网状内皮增生症病毒(REV)共感染,并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现,临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64.7%~78.8%,但与MDV强毒株的同源性高达98.9%~100.0%;gE和gI基因的核苷酸序列同源性均较高,分别为99.1%~99.9%和99.3%~100.0%。系统发生树分析结果表明,HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明,3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV-1毒株,其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。     

一例肉种鸡马立克氏病的诊断

为确定一发生肿瘤性疾病肉种鸡场的致病原因,通过PCR检测、病理组织学检查查找致病病原。PCR检测禽白血病病毒、网状内皮组织增生病病毒阴性,马立克氏病病毒(MDV)阳性;肝脏组织淋巴细胞呈浸润式生长,增生的多形淋巴细胞有明显的核分裂相。通过鸡胚成纤维细胞从发病鸡的外周血中分离到MDV,对分离毒株病毒基因组中132 bp重复序列、Meq基因核苷酸序列分析,发现分离到的毒株符合MDV强毒株特征。结果表明,MDV强毒株是导致该肉种鸡场鸡群发病的致病原因。     

黄羽父母代种鸡混合感染禽白血病病毒与马立克病病毒的鉴定

广西某养殖场130日龄父母代种鸡发生临床肿瘤样病变和死亡,对病鸡采用病理解剖、组织病理学观察、PCR检测、病毒分离以及分离株重要基因的序列测定和病原鉴定。结果显示:病鸡的心脏、肝脏、脾脏等部位表现有肿瘤样病变; PCR检测及病毒分离培养有J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)的感染; ALV-J分离株env基因的序列与10株ALV-J参考株的核苷酸相似性为87. 2%～97. 7%,与ALV A-E亚型参考株的相似性为53. 5%～54. 7%;与ALV-J英国原型株HPRS-103的env基因糖基化位点进行分析比较,部分糖基化位点发生了改变; MDV分离株meq基因序列与8株MDV参考株的核苷酸相似性为98. 7%～99. 4%,分离株在第71～80位氨基酸发生突变,符合国内强毒分离株的特征。结果说明:该鸡群为ALV-J和MDV的混合感染。     

马立克氏病毒TMR和TR基因的研究进展

马立克氏病(MD)是由马立克氏病毒(MDV)引起的鸡淋巴组织增生性传染病,对养禽业危害巨大。MDV线性基因组末端具有与宿主鸡序列相同的端粒重复序列(TMR),这些TMR有助于在潜伏期将MDV基因组整合到宿主端粒区,从而使病毒终生留在宿主体内。整合到宿主端粒对于MDV致病及诱导肿瘤发生至关重要,也能够有效地重新激活整合的病毒基因组。除TMR外,MDV还编码端粒酶RNA亚基(vTR),其与鸡基因组中端粒酶RNA(chTR)具有88%的序列相似性。vTR在病毒生命周期的所有阶段高度表达,增强端粒酶活性并在MDV诱导的肿瘤形成中起重要作用。文章重点介绍MDV基因组TMR序列和TR基因的最新研究进展。     

一株鸡马立克氏病病毒的分离鉴定及主要致病基因分析

山东省某地区鸡马立克氏病疫苗免疫鸡群暴发马立克氏病(MD),为分离得到致病毒株,检测其致病性,采用琼脂扩散试验、细胞培养和间接免疫荧光试验(IFA)等方法从发病鸡的血液及羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞(CEF)生长的马立克氏病病毒。采用PCR方法扩增分离毒株的meq、pp38、132bp重复序列等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比对分析。结果显示,该分离株SDAU-1的pp38基因与标准强毒序列同源性为100%,132bp重复序列的拷贝数及meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征。     

利用CRISPR/Cas9技术缺失MDV分离株meq基因的研究

鸡马立克氏病病毒(MDV)是一种能够引起鸡肿瘤的疱疹病毒,具有严格的细胞结合特性,对其基因组编辑较为困难。研究利用CRISPR/Cas9技术对中国MDV分离株基因组中的meq基因进行缺失。依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列,设计了8条靶向meq基因的小向导RNA(sgRNA),分别克隆到pX330质粒中,构建表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeqsgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果,选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞(CEF)上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒,接种MDV分离株BS/15株,通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株,成功克隆到一株meq基因缺失株。序列分析证明获得的MDV重组毒株确定meq基因序列已被敲除。体外试验证明该MDV重组毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法,为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。     

鸡马立克病病毒814株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析

从感染鸡马立克病病毒血清Ⅰ型(MDVⅠ)814株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取病毒总DNA,以其为模板,根据GenBank中MDVⅠ GA株基因组gE、gI、gp82基因序列,设计并合成3对特异性引物,用PCR方法分别扩增了814株的gE、gI、gp82基因,并将扩增的基因片段克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,应用DNA Star软件分析814株gE、gI、gp82基因核苷酸序列,并与已发表的MDVⅠ毒株序列进行了比较.结果表明,不同MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因同源性很高,814株与已发表的MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因核苷酸序列同源性分别在99.4%、98.9%和99.6%以上.     

免疫鸡感染马立克氏病病毒的诊断

采用细胞培养和免疫荧光试验从河南某种鸡场已免疫马立克氏病疫苗的产蛋期发病肉种鸡中成功分离到一株马立克氏病病毒,命名为MDV/He N15。用PCR方法对其pp38、meq和g B基因进行序列分析,与Gen Bank参考序列比较发现,分离株meq和pp38基因与Ⅰ型MDV毒株的同源性分别达到99.0%~99.8%和99.8%~100%,g B基因序列与参考株GX0101序列完全一致,基因上具有强毒特征。表明在免疫过疫苗的鸡群中仍然存在MDV强毒感染的风险。     

鸡马立克病疫苗株CVI988/Rispens meq基因编辑及缺失毒株的构建与鉴定

meq是鸡马立克病病毒(MDV)最重要的致瘤基因,在马立克病(MD)肿瘤发生中发挥关键作用。同时,它在疫苗株和强毒株之间具有明显的序列差异性。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以MDV疫苗株CVI988/Rispens meq基因为靶点,设计合成gRNA,克隆构建pX459-gRNA质粒,转染CEF并感染CVI988/Rispens,然后对meq基因编辑的病毒噬斑进行克隆纯化,经过PCR扩增、测序分析及IFA鉴定,成功构建1株meq基因编辑的缺失毒株CVI988Δmeq-C7,为后续筛选和鉴定抗MD疫苗株MEQ单抗及鉴别诊断研究奠定了基础。     

表达禽网状内皮组织增生病病毒env基因的重组马立克病毒的生物学特性

旨在构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REV)env基因的重组马立克病毒(Marek′s disease virus,MDV),并对其生物学特性进行初步研究。以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+);以其为模板,PCR扩增整个REVenv基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;以其为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REVenv真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用Red E/T同源重组技术插入SC9-1的meq位点,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。提取SC9-env BAC质粒转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性病毒,命名为SC9-env。分析比较SC9-env在CEF细胞上的复制水平,利用动物试验初步评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env能够稳定表达REV env蛋白,且复制水平与亲本病毒SC9-1相似;该重组毒接种SPF鸡没有明显的致病性,且对rMd5的强毒攻击提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显著;SC9-env显著降低REV感染SPF鸡所引起的体重减轻以及灭活苗抗体下降。构建的表达REVenv的重组MDV对感染MDV、REV的SPF鸡具有良好的免疫保护效果。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA.     

鸡马立克氏病病毒的分子生物学研究

鸡马立克氏病（MD）,是由鸡马立克氏病病毒（MDV）引起的淋巴增生性疾病,病毒经空气传播,传染力很强,被感染鸡产生肿瘤和死亡,给养鸡业主造成了巨大的经济损失.在国外,MD已成20世纪50年代以来最受重视的鸡病之一.MDV感染可引起肿瘤，同时还能引起感染鸡的免疫抑制。MDV疫苗自20世纪60年代末用于生产后，已大大降低了本病所造成的损失一MDV是少数几种能在自然宿主中诱导产生肿瘤的疱疹病毒之一。     

三黄鸡群混合感染禽白血病病毒和马立克氏病病毒导致的临床肿瘤初步研究

为了进一步研究禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)与马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)的流行趋势和致病机理,试验对三黄鸡疑似肿瘤样品中ALV-J的gp85基因和MDV的meq基因进行PCR扩增、克隆和序列测定与比较分析。结果表明:GX15PP03-ALV的gp85基因与ALV-J英国原型株HPRS-103的核苷酸及氨基酸的同源性分别为97.9%和96.8%,与其他8株国内外参考株的核苷酸及氨基酸的同源性分别为87.9%~99.7%和83.7%~99.0%;GX15PP03-MDV的meq基因与8个MDV强毒参考株的核苷酸及氨基酸的同源性分别为99.0%~99.8%和97.4%~99.4%,而且具有强毒株的序列特征。说明ALV-J和MDV混合感染是导致该鸡群临床爆发肿瘤的主要原因。     

鸡马立克病病毒康乐株meq基因的克隆与分析

为了解甘肃省鸡群马立克病病毒(MDV)的分子流行病学特征及meq基因的遗传演化规律,以甘肃省康乐县某鸡场马立克病的自然发病鸡为研究对象,采集9只病鸡肝脏组织,提取肝细胞基因组DNA,进行meq基因的PCR扩增、克隆及测序,将所得序列用BioEdit软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析。结果显示,MDV meq基因在进化上存在某种地理位置上的相关性,国内毒株成为一个分支,国外毒株成为另一个分支。本研究所获9株康乐株与国内近几年分离株GXY2、0095亲缘关系很近,与国内近几年分离株的核苷酸同源性在99.3%以上,且第319位核苷酸由T突变成C,第502位核苷酸由C突变成G,这两处突变是近几年国内分离的野毒株特有的。此外,9株康乐株均在550位核苷酸由C突变成T,其中4株在304、306位核苷酸由G突变为A和C,这些突变是否与毒株致肿瘤性和毒力有关,有待探究。     

脂质体介导马立克病病毒DNA转染鸡胚成纤维细胞

利用粗提的马立克病病毒(MDV)CVI988感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA与脂质体包裹转染CEF,获得具有感染性的MDV。结果表明,使用3μg MDV感染的CEF总DNA转染CEF,6 d~7 d后可形成0~16个MDV特有空斑。