马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒(MDV)感染性克隆基因组中细菌人工染色体(BAC)序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1~10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示,1~5代病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre/loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDV meq基因缺失株SC9-1的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。     

多重实时荧光PCR检测禽网状内皮组织增生症病毒方法的建立以及初步应用

本文建立了一种快速、灵敏、特异性强的禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)检测方法,并对REV在鸡胚成纤维细胞(chick embryo fi broblast,CEF)上的增殖动态规律进行研究。分别针对gag、env以及LTR基因的保守序列设计3对引物,利用重组质粒作为模板,绘制3种不同基因的标准曲线。检测结果显示,本研究建立了多重实时荧光PCR检测方法,所制备的标准品模板在108~101copies范围内与Ct值之间呈现良好的线性关系,且最低检出量为101copies。REV感染CEF后gag、env、LTR基因的拷贝数均先减少后增多。通过实时荧光PCR技术与间接免疫荧光方法检测,发现REV在CEF上复制的初始阶段呈现病毒适应过程,此后病毒大量复制,表现出明显的增长趋势。该研究不仅为REV的诊断技术提供了一种新的方法,同时也为深入研究REV的感染机制和致病机理奠定了基础。     

表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90蛋白的重组马立克氏病病毒的构建及生物学特性分析

禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病。为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框架克隆入pENTR1载体,获得重组质粒pENTR1-gp90。通过pENTR1-gp90与p814-5US2KanccdB重组粘粒的LR反应,将gp90表达框架插入p814-5粘粒中MDV 814疫苗株基因组US2基因内,构建重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得重组MDV r814-gp90株。将该重组病毒在CEF中连续传至20代后对第5、10、15、20代病毒经PCR扩增并测序鉴定;利用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测重组MDV感染细胞中gp90蛋白的表达;绘制重组MDV的生长曲线,分析其体外复制特性。结果显示,正确构建了含有gp90表达框架的重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染CEF后能够引起典型的蚀斑病变,且蚀斑形态大小与亲本病毒814株无明显差异。PCR及测序鉴定结果显示,重组病毒r814-gp90基因组中正确插入gp90基因表达框架,且其能够在该重组病毒中稳定存在。IFA及western blot检测结果表明,r814-gp90株能够在感染的CEF中表达gp90蛋白。体外生长曲线显示,r814-gp90株在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。以上结果表明,本研究正确构建了表达REV保护性抗原gp90基因的重组MDV,为研制RE重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对RE以及REV与MDV混合感染的防控具有重要意义。     

表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术缺失MDV分离株meq基因的研究

鸡马立克氏病病毒(MDV)是一种能够引起鸡肿瘤的疱疹病毒,具有严格的细胞结合特性,对其基因组编辑较为困难。研究利用CRISPR/Cas9技术对中国MDV分离株基因组中的meq基因进行缺失。依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列,设计了8条靶向meq基因的小向导RNA(sgRNA),分别克隆到pX330质粒中,构建表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeqsgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果,选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞(CEF)上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒,接种MDV分离株BS/15株,通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株,成功克隆到一株meq基因缺失株。序列分析证明获得的MDV重组毒株确定meq基因序列已被敲除。体外试验证明该MDV重组毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法,为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。     

禽网状内皮组织增生症病毒env蛋白的表达及其在ELISA方法中的应用

以pb101质粒为模板,PCR扩增禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜糖蛋白env基因片段.构建原核表达质粒pGEX-4T-3-env后,转化入宿主菌BL21,IPTG诱导表达env蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析.结果表明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性,相对分子质量约66.4 ku.将表达产物纯化后作为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法(Ienv-ELISA).经应用表明该方法具有良好的特异性、可重复性和敏感性,与IFA及iREV-ELISA结果相比其准确率均超过90%.该方法为检测REV抗体提供了一种快速、准确、简便的技术手段.     

马立克氏病毒强毒GD0908株感染性克隆的构建

为研究马立克氏病毒(MDV)新型疫苗及MDV致病机理,将MDV强毒GD0908株的全基因组作为细菌人工染色体(BAC)转化进大肠杆菌,构建GD0908株的感染性克隆.利用同源重组将BAC载体插入MDV基因组的US2区,将包含BAC载体的MDV DNA电转化入大肠杆菌菌株DH10B,最后将鉴定成功包含GD0908株全基因组的BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),成功拯救出重组病毒,命名为rGD0908,其与父代病毒GD0908株在CEF细胞上的生长速度没有差异.该感染性克隆将为MDV的相关研究提供技术平台.     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA.     

鸡马立克病疫苗株CVI988/Rispens meq基因编辑及缺失毒株的构建与鉴定

meq是鸡马立克病病毒(MDV)最重要的致瘤基因,在马立克病(MD)肿瘤发生中发挥关键作用。同时,它在疫苗株和强毒株之间具有明显的序列差异性。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以MDV疫苗株CVI988/Rispens meq基因为靶点,设计合成gRNA,克隆构建pX459-gRNA质粒,转染CEF并感染CVI988/Rispens,然后对meq基因编辑的病毒噬斑进行克隆纯化,经过PCR扩增、测序分析及IFA鉴定,成功构建1株meq基因编辑的缺失毒株CVI988Δmeq-C7,为后续筛选和鉴定抗MD疫苗株MEQ单抗及鉴别诊断研究奠定了基础。     

利用SYBR Green real-time PCR方法监控鸡外周血淋巴细胞中马立克病毒的载量

建立基于SYBR Green Ⅰ的real-time FQ-PCR方法检测并定量鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)中马立克病毒(Marek's disease virus,MDV)的载量(以meq基因为定量标准),并将此技术的敏感性与标准PCR方法进行对比.应用PCR技术从MDV-1攻毒后的霞烟鸡PBLs中扩增MDV meq基因的部分片段,纯化上述基因的DNA扩增产物,然后克隆到pGM-T载体,重组质粒通过PCR和EcoR Ⅰ酶切及测序分析进行确认；将浓度梯度的meq基因的重组标准品质粒DNA进行real-time FQ-PCR,建立其相应的标准曲线.同样以质粒DNA为模板,real-time FQ-PCR方法的最低检出率为10拷贝,而标准PCR的最低检出率则为32拷贝.结果表明,在检测MDV时,real-time FQ-PCR敏感度比标准PCR要高.     

禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学分析方法的建立及应用

根据NCBI公布的禽内源性反转录病毒ALVE1序列设计引物,以SPF鸡胚制备的成纤维细胞为生物材料,建立了ALVE基因序列分析、甲基化水平和转录表达检测方法。以鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast cell,CEF)和巨噬细胞系(HD11)两种细胞的基因组为模板,通过常规PCR扩增获得了1912 bp的扩增产物,测序后与内源性ALVE1序列比对,核苷酸同源性高达98%以上,说明扩增产物为内源性病毒序列。同时,利用焦磷酸测序分析LTR片段甲基化水平,结果显示,LTR在非免疫细胞CEF中的甲基化水平显著高于巨噬细胞系HD11。利用常规RT-PCR和荧光定量PCR在两种细胞均检测到禽内源性反转录病毒LTR基因、gag基因、pol基因和env基因的转录表达。本研究为今后分析禽内源性反转录病毒ALVE功能提供了方法,同时也为深入研究禽内源性反转录病毒ALVE表观遗传学调控机制奠定了基础。     

不同代次缺失meq基因的重组马立克病毒SC9-1株主要基因序列同源性分析

分析缺失meq基因的重组马立克病病毒SC9-1原代、10代及40代主要基因序列的同源性。提取缺失meq基因的重组马立克病病毒SC9-1原代、10代及40代DNA,设计引物PCR扩增其与致瘤相关pp38基因、缺失meq基因后残余的FRT位点序列及囊膜蛋白基因gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK,连接pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆进行测序,DNAStar软件对3代次各基因片段进行同源性比对。不同代次SC9-1病毒株的致瘤相关pp38基因、残留FRT位点序列及囊膜蛋白基因gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK的核苷酸序列同源性均为100%,核苷酸序列差异性分析结果显示序列完全一致,无位点上的变化。缺失meq基因的重组马立克病病毒SC9-1在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的传代过程中其致瘤相关pp38基因、残留FRT位点序列及囊膜蛋白基因gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK没有发生变异,侧面反映了SC9-1在CEF细胞传代过程中具有很好的遗传稳定性。     

禽网状内皮组织增生病病毒env蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究

为评价禽网状内皮组织增生病病毒(REV) env蛋白的免疫原性,本研究将env基因克隆至毕赤酵母表达载体pAO815,构建了含有两个env表达盒(已突变env基因中BglⅡ和Bam HⅠ酶切位点)的重组表达质粒pAO815-2env,并电转至毕赤酵母宿主菌GS115,构建重组酵母菌株pAO815-2env/GS115,经发酵培养得到的env蛋白(蛋白含量达到4.8 g/L)经亲和层析纯化后免疫SPF鸡,利用ELISA试剂盒和中和试验检测血清中的REV抗体。结果显示,重组酵母菌株表达的env蛋白,不仅能够诱导SPF鸡产生抗REV抗体,还能诱导其产生中和抗体,且产生的中和抗体效价较高,具有良好的免疫原性。本研究为开展禽网状内皮组织增生病亚单位疫苗的研制提供了实验依据。     

马立克病病毒与禽网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组

旨在了解国内鸡群马立克病病毒(MDV)和禽网状内皮增生病病毒(REV)的混合感染及自然重组状况,探讨两种病原的基因重组对MDV病原学特性的潜在影响及危害。利用PCR扩增、序列测定及间接免疫荧光试验(IFA),对来自河南商品蛋鸡群的17个MDV分离株进行研究。结果表明,其中两个毒株HNGS206和HNXZ103的病毒基因组中存在REV—LTR的重组插入。进一步的IFA结果显示,HNGS206和HNXZ103并非MDV与REV的自然重组流行毒株,这两个毒株基因组中LTR的插入发生于临床病例鸡混合感染后的病毒分离及传代培养过程中。结果提示,虽然目前国内鸡群中MDV和REV的混合感染较为普遍,但MDV与REV自然重组毒株的流行状况仍需要进一步的流行病学监测。     

禽网状内皮组织增生症病毒囊膜糖蛋白gp90的原核表达

根据禽网状内皮组织增生症病毒（REV）SNV株的前病毒基因组cDNA序列，设计并合成1对引物，以SNV株前病毒CDNA全基因组克隆为模板，通过PCR技术，扩增出该病毒囊膜糖蛋白（env)gp90基因部分片段。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-5X-3载体中谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在1.0mmol/L IPTG(37℃）诱导下，gp90基因部分片段以融合蛋白的形式获得了良好的表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白相对分子质量为64000。将表达产物从凝胶中回收后免疫小鼠，所得的抗血清可与REV野毒株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在免疫荧光试验中起反应。由此表明，体外表达的SNV株gp90-GST融合蛋白保留了天然蛋白所具有的抗原性。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白Ⅰ的原核表达及多克隆抗体的制备

提取感染MDV 814A3毒株的鸡胚成纤维细胞(CEF)总基因组,利用PCR技术扩增获得gI基因.将鉴定正确的gI基因克隆至pET-32a(+),构建原核表达载体pET-gI.将诱导表达获得的gI重组蛋白免疫新西兰大白兔,产生的抗血清能够与MDV814A3病毒发生特异性反应.本试验所制备的gI重组蛋白和多克隆抗体将在MDV检测、血清学诊断等方面具有重要应用价值.     

河南土鸡群马立克病病毒流行毒株的分离鉴定及分子进化分析

本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)流行毒株,了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病(MD)的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132-bp重复序列基因的特异性引物,应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊,并通过鸡胚成纤维细胞(CEF)盲传培养和间接免疫荧光试验(IFA)分离鉴定了3个流行毒株,分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示,3个MDV分离株均为血清1型(MDV-1)毒株,未发生禽网状内皮增生症病毒(REV)共感染,并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现,临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64.7%~78.8%,但与MDV强毒株的同源性高达98.9%~100.0%;gE和gI基因的核苷酸序列同源性均较高,分别为99.1%~99.9%和99.3%~100.0%。系统发生树分析结果表明,HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明,3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV-1毒株,其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。     

黄羽父母代种鸡混合感染禽白血病病毒与马立克病病毒的鉴定

广西某养殖场130日龄父母代种鸡发生临床肿瘤样病变和死亡,对病鸡采用病理解剖、组织病理学观察、PCR检测、病毒分离以及分离株重要基因的序列测定和病原鉴定。结果显示:病鸡的心脏、肝脏、脾脏等部位表现有肿瘤样病变; PCR检测及病毒分离培养有J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)的感染; ALV-J分离株env基因的序列与10株ALV-J参考株的核苷酸相似性为87. 2%～97. 7%,与ALV A-E亚型参考株的相似性为53. 5%～54. 7%;与ALV-J英国原型株HPRS-103的env基因糖基化位点进行分析比较,部分糖基化位点发生了改变; MDV分离株meq基因序列与8株MDV参考株的核苷酸相似性为98. 7%～99. 4%,分离株在第71～80位氨基酸发生突变,符合国内强毒分离株的特征。结果说明:该鸡群为ALV-J和MDV的混合感染。     

禽网状内皮组织增生症病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备

为原核表达禽网状内皮组织增生症病毒(REV)env蛋白及制备抗env蛋白的高效价多克隆抗体,本研究以pMD18T-env(HLJR0901株)为模板,扩增得到REV的env全长基因,将其克隆于pET-32a(+)中。将阳性重组质粒pET-env转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠,制备抗env多克隆血清。SDS-PAGE及western blot结果表明,env基因以融合蛋白形式获得正确表达,相对分子质量约为84ku,表达产物具有良好免疫原性;IFA结果显示,制备的抗env多克隆血清能与REV野毒株特异性反应;ELISA效价达到1∶105以上。该研究为REV的检测及env蛋白的深入研究奠定了基础。     

MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失BAC克隆株的构建及其体外增殖特性

为构建缺失马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)Meq基因簇microRNAs(Meq-clustered miRNAs的突变株,本研究在vv MDV GX0101细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)克隆的基础上,采用Red/ET同源重组技术将Meq-clustered miRNAs的编码基因进行缺失突变,经PCR鉴定及序列分析证明Meq-cluster miRNAs序列成功缺失后,提取Δmeq-miRNAs BAC DNA,转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行病毒拯救,用SYBR GreenⅠqRT-PCR检测病毒体外增殖特性。结果表明成功拯救出缺失MDV Meq-clustered miRNAs基因的感染性BAC克隆株GX0101Δmeq-miRNAs,且该缺失株与亲本株GX0101BAC具有相似的增殖曲线,Meq-clustered miRNAs是MDV体外复制的非必需基因。MDV Meq-clustered miRNAs基因缺失感染性BAC克隆株的成功构建为进一步研究MDV Meq-clustered miRNAs在MDV致病和致肿瘤方面的作用奠定了基础。