鸡马立克病病毒814株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析

从感染鸡马立克病病毒血清Ⅰ型(MDVⅠ)814株的鸡胚成纤维细胞(CEF)中提取病毒总DNA,以其为模板,根据GenBank中MDVⅠ GA株基因组gE、gI、gp82基因序列,设计并合成3对特异性引物,用PCR方法分别扩增了814株的gE、gI、gp82基因,并将扩增的基因片段克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,应用DNA Star软件分析814株gE、gI、gp82基因核苷酸序列,并与已发表的MDVⅠ毒株序列进行了比较.结果表明,不同MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因同源性很高,814株与已发表的MDVⅠ毒株的gE、gI、gp82基因核苷酸序列同源性分别在99.4%、98.9%和99.6%以上.     

3株马立克氏病病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病(MD)毒株目前的流行情况,在我国3个已免疫MD疫苗的白羽肉种鸡场暴发MD的鸡群中,通过临床剖检,组织病理学变化,病毒分离,IFA检测从发病鸡的淋巴细胞中分离到3株马立克氏病毒(MDV),并分别命名为SDAU1501、SDAU1502和SDAU1503。采用PCR方法扩增3株MDV的vIL8、pp38、meq致病基因,所得氨基酸序列与已发表的参考毒株序列进行比较分析,结果显示SDAU1501和SDAU1502的致病基因与强毒株的同源性达到97%以上,具有强毒特征;而SDAU1503的meq基因在第194位具有与CVI988同样的缺失(P),但其没有CVI988中177个核苷酸的插入突变,其具有与弱毒疫苗株的特征。MDV新的变异在不断发生,出现了不同类型的变异株,因此,对MD的流行情况与基因监测应当继续下去;同时,在MDV疫苗的研制更新上还有待于进一步研究。     

一株鸡马立克氏病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

吉林省某地区鸡马立克氏病（MD）疫苗免疫鸡群暴发MD,从发病鸡羽髓中分离到一株适应鸡胚成纤维细胞生长的马立克氏病毒（MDV）。该毒株感染无特定病原体（SPF）鸡可引起典型的MD临床症状：对非免疫鸡和火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗免疫鸡的致病率分别为76％和72％,二者无显著差异,表明HVT疫苗对该毒株不能提供有效保护。通过对该毒株病毒基因组中132bp重复序列、meq基因的核苷酸及推导的氨基酸序列分析,发现该毒株的132bp重复序列的拷贝数、meq基因的变异符合高毒力MDV毒株的特点。     

整合进禽反转录病毒长末端重复序列的马立克氏病病毒的分离鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从曾免疫过CVI988/Rispens株疫苗的患马立克氏病(MD)肿瘤的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV,命名为GXY2株。用禽肿瘤病聚合酶链式反应(PCR)鉴别诊断技术对患鸡的肿瘤组织病料及克隆纯化毒株的DEF培养物进行检测,结果均扩增到MDV-1强毒株的132-bpr特异性带和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)。用基于抗MDV-1的gB蛋白单克隆抗体BA4、MEQ蛋白单克隆抗体3G12E6和抗REV的单克隆抗体11B118分别对毒株的培养物进行间接免疫荧光试验(IFA),结果样品只与抗MDV-1的单克隆抗体呈现阳性反应,而与抗REV的单克隆抗体呈现阴性反应。应用PCR技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,结果发现其序列与我们之前分离鉴定的MDV-1野强毒株G2和YL040920高度同源。研究的结果表明,分离株GXY2为整合有REVLTR片段的重组MDV强毒株。     

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRV gE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病(PR)疫苗提供科学依据。     

三黄鸡群混合感染禽白血病病毒和马立克氏病病毒导致的临床肿瘤初步研究

为了进一步研究禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)与马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)的流行趋势和致病机理,试验对三黄鸡疑似肿瘤样品中ALV-J的gp85基因和MDV的meq基因进行PCR扩增、克隆和序列测定与比较分析。结果表明:GX15PP03-ALV的gp85基因与ALV-J英国原型株HPRS-103的核苷酸及氨基酸的同源性分别为97.9%和96.8%,与其他8株国内外参考株的核苷酸及氨基酸的同源性分别为87.9%~99.7%和83.7%~99.0%;GX15PP03-MDV的meq基因与8个MDV强毒参考株的核苷酸及氨基酸的同源性分别为99.0%~99.8%和97.4%~99.4%,而且具有强毒株的序列特征。说明ALV-J和MDV混合感染是导致该鸡群临床爆发肿瘤的主要原因。     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

猪伪狂犬病毒流行株JL1株主要基因的遗传变异分析

为了解我国吉林省某地区猪伪狂犬病毒流行株JL1株的遗传变异情况,对PRV JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因进行克隆测序,并与GenBank上发表的国内外毒株进行序列分析和遗传进化分析。结果显示,JL1株TK、gI、gD、gE和gB基因与国内外其他参考毒株的核苷酸同源性为99.6%~100%,96.4%~99.9%,98.8%~99.9%,98.1%~99.9%,98.4%~99.9%;氨基酸同源性为99.4%~100%,94.3%~99.7%,97.3%~99.8%,95.7%~99.5%,97%~99.7%。氨基酸多序列比对发现,PRV JL1株gE基因第48位和496位各插入一个天冬氨酸(D),与流行变异株的基因特征一致;同时gD基因、gI基因和gB基因分别有不同数量的氨基酸的插入和缺失。遗传进化分析表明,JL1株与国内近年来分离的流行毒株亲缘关系较近,尤其与JS-2012流行毒株亲缘关系相对最近,而与国外分离的经典毒株亲缘关系较远。通过对PRV JL1流行毒株的重要基因进行遗传变异分析,进一步了解PRV变异情况,可为当前流行的猪伪狂犬病防控以及疫苗的研究提供参考依据。     

不同代次缺失meq基因的重组马立克病毒SC9-1株主要基因序列同源性分析

分析缺失meq基因的重组马立克病病毒SC9-1原代、10代及40代主要基因序列的同源性。提取缺失meq基因的重组马立克病病毒SC9-1原代、10代及40代DNA,设计引物PCR扩增其与致瘤相关pp38基因、缺失meq基因后残余的FRT位点序列及囊膜蛋白基因gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK,连接pMD18-T载体,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆进行测序,DNAStar软件对3代次各基因片段进行同源性比对。不同代次SC9-1病毒株的致瘤相关pp38基因、残留FRT位点序列及囊膜蛋白基因gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK的核苷酸序列同源性均为100%,核苷酸序列差异性分析结果显示序列完全一致,无位点上的变化。缺失meq基因的重组马立克病病毒SC9-1在鸡胚成纤维细胞(CEF)上的传代过程中其致瘤相关pp38基因、残留FRT位点序列及囊膜蛋白基因gB、gC、gD、gE、gH、gI、gK没有发生变异,侧面反映了SC9-1在CEF细胞传代过程中具有很好的遗传稳定性。     

免疫鸡感染马立克氏病病毒的诊断

采用细胞培养和免疫荧光试验从河南某种鸡场已免疫马立克氏病疫苗的产蛋期发病肉种鸡中成功分离到一株马立克氏病病毒,命名为MDV/He N15。用PCR方法对其pp38、meq和g B基因进行序列分析,与Gen Bank参考序列比较发现,分离株meq和pp38基因与Ⅰ型MDV毒株的同源性分别达到99.0%~99.8%和99.8%~100%,g B基因序列与参考株GX0101序列完全一致,基因上具有强毒特征。表明在免疫过疫苗的鸡群中仍然存在MDV强毒感染的风险。