鸡肿瘤病料中马立克氏病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒共感染的研究

采用细胞培养、间接荧光抗体试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)和斑点杂交(Dotblot)的方法从我国不同地区发生肿瘤的病料中同时进行MDV和REV的分离和鉴定。在分离到的13株MDV野毒株中，有4株培养物既能在IFA中与REV的单抗反应，又可以用PCR扩增出REV的LTR；另有4株培养物能扩增出REV的LTR，但在IFA中却不与REV的单抗反应。结果表明我国MD肿瘤中存在着REV的共感染，且我国MDV某些野毒株的基因组中有可能已经整合进了REV的LTR序列。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA.     

网状内皮增生症病毒长末端重复序列插入马立克氏病毒超强株细菌人工染色体对其致病性的影响

马立克氏病毒(MDV)JM/102M株和禽网状内皮增生症病毒(REV)共同培养产生包含了REV长末端重复序列(LTR)的重组MDV,命名为RM 1株,其致瘤性大大减弱,但能引起严重的法氏囊和胸腺萎缩。假设这种表型的改变仅仅是由于LTR的插入,且LTR插入不同MDV株的相同位点会产生相似的表型改变。为了验证这些假设,将REV LTR插入MDV超强毒株Md5的细菌人工染色体克隆(BAC),命名为rMd5-RM1-LTR。rMd5-RM1-LTR病毒和rMd5病毒在鸭胚成纤维细胞传40代,然后进行致病性研究。易感鸡孵化时通过腹腔接种rMd5-RM1-LTR、rMd5BAC母本病毒、野生Md5株或RM1株。rMd5-RM1-LTR病毒经细胞培养40代毒性减弱,而没有插入RM1LTR的rMd5BAC传40代后仍然保持了其致病性。采用PCR在从接种rMd5-RM1-LTR鸡的软层细胞分离的MDV中检测到了RM1LTR的插入,但仅能在接种后1周检测到。数据显示,于孵化时接种病毒后1周在MDV基因组中出现的RM1LTR插入能有效减弱MDV Md5株的致病性。     

表达禽网状内皮组织增生病病毒gp90蛋白的重组马立克氏病病毒的构建及生物学特性分析

禽网状内皮组织增生病(RE)是禽类一种重要免疫抑制性疾病,目前尚无有效的商品化疫苗预防该病。为研制表达RE病毒(REV)gp90蛋白的重组鸡马立克氏病病毒(MDV),本研究构建了含有REV保护性抗原基因gp90的pCAGGS-gp90表达质粒,将gp90表达框架克隆入pENTR1载体,获得重组质粒pENTR1-gp90。通过pENTR1-gp90与p814-5US2KanccdB重组粘粒的LR反应,将gp90表达框架插入p814-5粘粒中MDV 814疫苗株基因组US2基因内,构建重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF),获得重组MDV r814-gp90株。将该重组病毒在CEF中连续传至20代后对第5、10、15、20代病毒经PCR扩增并测序鉴定;利用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot检测重组MDV感染细胞中gp90蛋白的表达;绘制重组MDV的生长曲线,分析其体外复制特性。结果显示,正确构建了含有gp90表达框架的重组粘粒p814-5-gp90。将该重组粘粒转染CEF后能够引起典型的蚀斑病变,且蚀斑形态大小与亲本病毒814株无明显差异。PCR及测序鉴定结果显示,重组病毒r814-gp90基因组中正确插入gp90基因表达框架,且其能够在该重组病毒中稳定存在。IFA及western blot检测结果表明,r814-gp90株能够在感染的CEF中表达gp90蛋白。体外生长曲线显示,r814-gp90株在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。以上结果表明,本研究正确构建了表达REV保护性抗原gp90基因的重组MDV,为研制RE重组MDV活载体疫苗奠定了基础,对RE以及REV与MDV混合感染的防控具有重要意义。     

禽网状内皮组织增生症病毒LN1201株的全基因组序列分析及其U3区的独特性

为比较分析近年来禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的基因组变异情况,本研究对分离自某父母代肉种鸡场患病鸡的REV LN1201株进行PCR扩增和克隆测序,获得了LN1201株的前病毒全基因组序列,并将其与不同参考株基因组进行了比较分析。结果显示,LN1201株前病毒基因组全长8 438 bp,具有典型复制完整型逆转录病毒的基因组结构。与参考株相比,LN1201与国内分离株HLJR0901和疫苗污染病毒株MD-2同源性较高,但其U3区与不同病毒株的同源性相对较低,并且在U3区出现了罕见的14 bp碱基插入,显示该病毒株可能为LTR发生重组的病毒。本研究有助于了解我国鸡群中REV的基因组特性,提示有必要继续关注REV诱发的肿瘤及其基因变异。     

河南土鸡群马立克病病毒流行毒株的分离鉴定及分子进化分析

本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)流行毒株,了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病(MD)的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132-bp重复序列基因的特异性引物,应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊,并通过鸡胚成纤维细胞(CEF)盲传培养和间接免疫荧光试验(IFA)分离鉴定了3个流行毒株,分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示,3个MDV分离株均为血清1型(MDV-1)毒株,未发生禽网状内皮增生症病毒(REV)共感染,并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现,临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64.7%~78.8%,但与MDV强毒株的同源性高达98.9%~100.0%;gE和gI基因的核苷酸序列同源性均较高,分别为99.1%~99.9%和99.3%~100.0%。系统发生树分析结果表明,HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明,3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV-1毒株,其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。     

整合进禽反转录病毒长末端重复序列的马立克氏病病毒的分离鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从曾免疫过CVI988/Rispens株疫苗的患马立克氏病(MD)肿瘤的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV,命名为GXY2株。用禽肿瘤病聚合酶链式反应(PCR)鉴别诊断技术对患鸡的肿瘤组织病料及克隆纯化毒株的DEF培养物进行检测,结果均扩增到MDV-1强毒株的132-bpr特异性带和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)。用基于抗MDV-1的gB蛋白单克隆抗体BA4、MEQ蛋白单克隆抗体3G12E6和抗REV的单克隆抗体11B118分别对毒株的培养物进行间接免疫荧光试验(IFA),结果样品只与抗MDV-1的单克隆抗体呈现阳性反应,而与抗REV的单克隆抗体呈现阴性反应。应用PCR技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,结果发现其序列与我们之前分离鉴定的MDV-1野强毒株G2和YL040920高度同源。研究的结果表明,分离株GXY2为整合有REVLTR片段的重组MDV强毒株。     

双价苗中马立克氏病病毒含量

用显微镜观察和间接发荧光抗体试验（IFA）分别测定某马立克氏病病毒双价苗中所含两种814毒株和HVT毒株的空斑数。结果表明，IFA检测的空斑数显著大于显微镜观察的空斑数，且双价茵中两种病毒的含量与这两种病毒混合前加入的比例基本一致。这表明用IFA对双价苗中的MDV进行空斑计数从而分别测定MDV的含量是完全可行的。     

3株马立克氏病病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

为了解国内鸡群马立克病(MD)毒株目前的流行情况,在我国3个已免疫MD疫苗的白羽肉种鸡场暴发MD的鸡群中,通过临床剖检,组织病理学变化,病毒分离,IFA检测从发病鸡的淋巴细胞中分离到3株马立克氏病毒(MDV),并分别命名为SDAU1501、SDAU1502和SDAU1503。采用PCR方法扩增3株MDV的vIL8、pp38、meq致病基因,所得氨基酸序列与已发表的参考毒株序列进行比较分析,结果显示SDAU1501和SDAU1502的致病基因与强毒株的同源性达到97%以上,具有强毒特征;而SDAU1503的meq基因在第194位具有与CVI988同样的缺失(P),但其没有CVI988中177个核苷酸的插入突变,其具有与弱毒疫苗株的特征。MDV新的变异在不断发生,出现了不同类型的变异株,因此,对MD的流行情况与基因监测应当继续下去;同时,在MDV疫苗的研制更新上还有待于进一步研究。     

黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株GX18NNM4的分离鉴定及其致瘤基因meq的序列分析

为探究黄羽肉鸡鸡群临床异常的发病原因,通过病理剖检、组织病理学观察、PCR检测、细胞培养、间接免疫荧光试验(Immunofluorescent assay,IFA)、序列测定进行病原分离鉴定。结果显示:病鸡心脏、肝脏等器官均有肿瘤样病变;常见肿瘤病病毒PCR检测呈现马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)阳性,细胞培养病毒分离及IFA鉴定结果表明成功分离一株MDV野毒株(命名为GX18NNM4);分离株meq基因的序列分析表明,GX18NNM4与vvMDV参考株GX0101的同源性最高,其核苷酸及氨基酸相似性分别高达99.8%和99.4%,且其突变位点符合国内强毒株的特征。通过氨基酸序列分析发现GX18NNM4的两个脯氨酸重复序列PPPP发生了突变,即PPPP→PNPP,且GX18NNM4与vvMDV/vv+MDV参考株RB1B、Md5、GX0101及648A的脯氨酸发生中断的数量同在0~3的范围内。结果表明该鸡群为MDV感染。     

2014年广西地方鸡群病毒性肿瘤病例的检测分析

2014年,广西地区部分鸡群发生了以内脏出现各种肉眼可见肿瘤、生长阻滞、消瘦和采食量下降为特征的病例。通过对病鸡进行肉眼剖检观察,对病料组织分别进行肿瘤病毒PCR检测、DF-1细胞分离培养及其细胞培养上清进行禽白血病病毒(ALV)p27抗原检测,结果显示12批病例中,单独感染ALV的鸡群有5群,单独感染马立克氏病病毒(MDV)的鸡群有1群,ALV与MDV的二重混合感染鸡群有4群,MDV和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的二重混合感染的鸡群有1群,ALV、MDV和REV的三重混合感染有1个鸡群。表明ALV的感染及其与其他肿瘤病毒的共感染是当前临床肿瘤病例的主要病因。     

我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测

为了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及其与禽网状内皮细胞增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性贫血病病毒(CAV)的混合感染现象,本研究从宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江7个省的39个蛋鸡群收集临床表现和剖检病理变化疑似禽白血病的病料样品184份,采用PCR、病毒分离和IFA检测样品中ALV-J、REV、MDV和CAV。结果表明,7个省蛋鸡场均存在ALV-J感染,病料样品阳性率为60.9%,检测鸡群阳性率为82.1%,与REV、MDV、CAV的混合感染率分别为13.6%、24.5%、22.8%,其中存在较为严重的双重感染(29.0%)和3重感染(18.8%),甚至4重感染(1.7%)。研究结果表明,我国蛋鸡群中普遍存在ALV-J感染,而且与REV、MDV、CAV混合感染严重;提示ALV-J已经可以引起蛋鸡群发病,在临床诊断和致病性研究中,应考虑到多重感染的影响。     

禽网状内皮组织增生症流行现状及检测技术研究进展

禽网状内皮组织增生症(RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病。近年来,国内外鸡群中网状内皮组织增生症病毒(REV)流行比较严重;REV与马立克病病毒(MDV)、鸡贫血病病毒(CAV)和J亚群禽白血病病毒(Avianleukosis virus subgroup J,ALV-J)几种免疫抑制性病毒的混合感染在我国部分养鸡场中均普遍存在,使得鸡群处于免疫力低下的状态,导致禽流感、新城疫等重要疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。另外,REV可以整合到MDV和鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)基因组中,从而导致商品化疫苗受到污染,并可用做将外源基因插入到鸡和哺乳动物细胞内的表达载体;基于REV传统检测方法的基础上,新型的分子生物学检测技术如PCR、实时荧光PCR、LAMP提高了诊断REV的敏感性和特异性。     

整合REV LTR的自然重组马立克氏病毒GX0101的全基因组序列分析

GX0101是一株整合禽网状内皮组织增生症病毒 (reticuloendotheliosis, REV) 长末端重复序列 (LTR) 的重组马立克氏病病毒 (Marek′s disease, MD)。本研究基于MDV GX0101的细菌人工染色体感染性克隆利用高通量测序技术完成了对其全基因组的序列分析。GX0101全基因组长178101bp, 其基因组的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS区分别长12758bp、113572bp、12741bp、12700bp、11695bp、13134bp。GX0101全基因组仅含有一个REV LTR重组片段,位于其基因组US区的sorf1中,sorf2基因前267bp碱基处。与rMd5不同,GX0101含有一个sorf2基因。通过与已发表的近10株MDV的比较, 发现GX0101与英国分离株C12/130的两个不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。GX0101的全基因组序列的比较分析,有助于进一步阐明MDV致病性、传播性相关的基因,也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。     

一例肉种鸡马立克氏病的诊断

为确定一发生肿瘤性疾病肉种鸡场的致病原因,通过PCR检测、病理组织学检查查找致病病原。PCR检测禽白血病病毒、网状内皮组织增生病病毒阴性,马立克氏病病毒(MDV)阳性;肝脏组织淋巴细胞呈浸润式生长,增生的多形淋巴细胞有明显的核分裂相。通过鸡胚成纤维细胞从发病鸡的外周血中分离到MDV,对分离毒株病毒基因组中132 bp重复序列、Meq基因核苷酸序列分析,发现分离到的毒株符合MDV强毒株特征。结果表明,MDV强毒株是导致该肉种鸡场鸡群发病的致病原因。     

2016年鲁北地区鸡群病毒性肿瘤病例的检测分析

为了解鸡马立克病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)和禽网状内皮组织增生症病毒(REV)在鲁北地区鸡群中的感染情况,对来自21个鸡群的送检病例进行了病原核酸的PCR检测.结果显示,MDV阳性率为28.5%,ALV-J阳性率为23.8%,REV阳性率为14.3%,肿瘤病毒的二重感染率为28.6%.结果表明,3种肿瘤病毒在鲁北地区蛋鸡和地方品种鸡群中的感染严重,病毒的混合感染较多.因此,做好MD的疫苗防护,对ALV-J及REV的感染状况要进行定期检测,控制好养殖环境,尽量避免3种肿瘤病毒的继发感染.     

鸡马立克氏病病毒在鸡淋巴细胞和羽髓中的复制动力学分析

马立克氏病（MD）是由鸡马立克氏病病毒血清1型（MDV1）引起的鸡高度接触性淋巴细胞增生性疾病,MDV1在体内的复制状况与其致病性强弱及传播能力直接相关。本实验选择近几年从国内不同地区MD暴发鸡场分离的6株MDV1强毒株、弱毒疫苗“814”株和国内标准MDV1强毒J-1株,分别人工感染SPF鸡,采用双重实时荧光定量PCR（FQ—PCR）方法,检测感染后1d～28d病毒在淋巴细胞和羽髓中的复制状况。结果显示,接种1d后即可在淋巴细胞中检测到MDV1（10^2.6 copies～10^5.2 copies／10^6 cells）;在检测期间,淋巴细胞中病毒载量略有上升的趋势,总体呈现不规律变化,而且变化并不明显。接种7d后羽髓中病毒载量开始显著增加,14d～21d达到峰值,超强毒株峰值处病毒载量可达到10^7 copies／10^6 cells,峰值期病毒载量是感染前期（1d～7d）的100～10000倍。强毒株在体内的病毒载量高于弱毒株,即复制能力高于弱毒株。研究表明,MDV1国内流行的毒株有增殖速度快,病毒载量高的新特点;MDV1致病性的高低与在其在体内的复制能力的高低呈正相关。     

商品代肉鸡群中禽网状内皮组织增生病病毒和马立克氏病病毒的混合感染

山东兖州某商品代肉鸡场的 2 0日龄肉鸡开始出现大批死亡 ,剖检发现肝脏、脾脏、肾脏和心脏等主要脏器均出现大小不等的肿瘤结节 ,采用细胞培养和间接荧光抗体试验的方法从这些病料中同时分离到了禽网状内皮组织增生病病毒 (REV)和马立克氏病病毒 (MDV) ,通过组织病理学检查和斑点杂交的方法表明该鸡场的疫病为REV和MDV共感染引起的肿瘤病。这是国内从商品代肉鸡中同时分离到REV和MDV的首次报道     

禽逆转录病毒防控新思路：CRISPR/Cas9

正禽网状内皮组织增生病病毒(REV)是一种感染禽类的免疫抑制性、致瘤性逆转录病毒,它可引起鸡、鸭、火鸡和其他禽类发生矮小综合征和慢性肿瘤,导致严重免疫抑制。当前REV在我国流行非常严重,是威胁我国养禽业健康发展的重要疫病之一。REV不仅可以发生单独感染,该病毒与其他禽类病毒混合感染的现象也十分普遍,这进一步增加了防控的难度。REV与鸡马立克氏病病毒(MDV)的混合感染以及重组不仅能够增强MDV的致病性,还加剧了MDV的不断变异。然而到目前为止,世界上还没有商品化疫苗用于REV的预防,也没有行     

禽网状内皮组织增生病诊断与防制研究进展

禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是禽类一种重要的致瘤性和免疫抑制性疾病.近年来,鸡群中REV流行比较严重;REV与马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)、鸡贫血病病毒((Chicken infectious anemia,CAV)和J亚群禽白血病病毒(Subgroup J Avian Leuko-sis Virus,ALV-J)等几种免疫抑制性病毒的混合感染也比较普遍.鉴于REV正越来越受到重视.本文就RE的诊断和综合防制作一综述.