罗布麻叶总黄酮提取物对抑郁大鼠脑内单胺类神经递质含量的影响

[目的]探讨罗布麻（Apocynum venetum L.）叶总黄酮提物抗抑郁作用的机理。[方法]采用大鼠慢性应激抑郁模型,利用液相色谱-质谱串联法测定大鼠脑内单胺类神经递质[去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）]的含量。[结果]慢性应激抑郁组动物组织内DA、5-HT和NE含量与正常组相比均极显著降低（P〈0.01）。罗布麻总叶黄酮提取物处理组大鼠脑中DA和NE含量与慢性应激抑郁组相比显著或极显著上升,且随着剂量的增大,这种作用更加明显;70.0 mg/kg罗布麻叶黄酮提取物处理与盐酸氟西汀（3.5mg/kg）效果一致;但罗布麻叶总黄酮提取物处理组大鼠脑中5-HT含量与慢性应激抑郁组相比没有明显变化,阳性对照药氟西汀显著增加了抑郁大鼠脑组织中DA、NE和5-HT含量。[结论]该研究证实了抑郁症发病的神经递质假说,同时发现罗布麻叶可以逆转抑郁大鼠脑内单胺类物质NE、DA含量的降低,这也可能是其抗抑郁作用的机理之一。     

重组小麦组蛋白H4介导绿色荧光蛋白基因(pEGFP/C1)的转染

利用在大肠杆菌体内表达的重组小麦组蛋白H4与质粒DNA形成复合体后,通过琼脂糖凝胶电泳迁移试验(EMSA)验证重组蛋白与DNA的结合情况;MTT法检测蛋白对细胞的毒性作用;转染细胞后,激光共聚焦显微镜检测荧光蛋白的表达。此重组蛋白能很好地结合质粒DNA,且能有效地保护DNA分子不受核酸酶降解,并能高效地携带绿色荧光蛋白基因pEGFP/C1转染进入卵巢癌细胞株H08910。     

潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。     

鸡MDV meq基因对鸡胚成纤维细胞p53基因表达的影响

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测了鸡马立克氏病病毒（MDV）meq基因对鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts,CEF）p53基因表达的影响,并用本室改进的TRAP法测定了端粒酶活性。结果显示,meq基因激活了CEF中原癌基因p53的表达,并且48 h的表达量是72 h的18.8倍;在对CEF和转染前后48、72 h的细胞端粒酶活性测定时也发现,端粒酶活性在转染后48 h是转染后72 h的16倍。流式细胞仪检测发现meq基因使S期细胞比例较转染前有所上升,进一步印证了meq基因是MDV中致瘤的主要因素。     

豌豆植物瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子研究

为探索豆科植物豌豆作为生物反应器瞬时表达外源重组蛋白的可行性,选择豌豆作为宿主植物,构建了含有酸性成纤维细胞生长因子基因的植物瞬时表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,并以叶片注射法进行接种,在豌豆植株中瞬时表达了人酸性成纤维细胞生长因子,接种后在紫外灯下跟踪观察绿色荧光蛋白的表达情况.研究结果表明,接种后8～10 d在紫外灯下可观察到GFP的表达,12～14 d GFP表达量最大.蛋白质杂交检测结果表明,酸性成纤维细胞生长因子在豌豆植物中成功表达,说明豌豆植物可作为植物瞬时表达外源蛋白新的选择平台.     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

罗布麻叶总黄酮抗抑郁作用参与NE能系统可能机制的研究

采用抗抑郁模型强迫游泳试验对罗布麻叶总黄酮的抗抑郁活性进行评价,同时选择相关NE受体阻断剂(α1-NE受体阻断剂→哌唑嗪、α2-NE受体阻断剂→育亨宾、αβ-NE受体阻断剂→普萘洛尔),采用小鼠悬尾试验探讨罗布麻叶总黄酮的抗抑郁机制。结果表明,罗布麻叶总黄酮具有抗抑郁作用;同时,与罗布麻叶总黄酮50 mg/kg单独给药相比α1、α2、αβ受体阻断剂哌唑嗪(1 mg/kg)、育亨宾(1 mg/kg)、普萘洛尔(2 mg/kg)与罗布麻叶总黄酮50 mg/kg联合连续灌胃给药10 d后,能明显延长悬尾小鼠累计不动时间,表明罗布麻叶总黄酮的抗抑郁活性与去甲肾上腺素能系统(α1、α2、αβ受体)有关。     

棘豆蠕孢菌发酵液中次级活性产物分离纯化初探

[目的]为寻找具有合成与宿主植物相同或相似活性成分能力的内生真菌奠定理论基础。[方法]利用布氏漏斗抽滤将菌丝体和发酵液分开,通过预处理除去发酵液中的杂蛋白、色素、高价金属离子和多糖,然后用大孔树脂分离发酵产物并利用硅胶柱层析进行纯化,最后通过红外光谱检测确定样品与宿主植物成分为同一类生物碱。[结果]样品在改良碘化铋钾的作用下呈橘红色斑点,在Ehrli-ch’s显色剂作用下呈紫红色斑点,两者的Rf值均为0.78。水洗脱段对3种沉淀试剂均呈阴性反应;醇水混合段对碘化铋钾呈阴性反应,对苦味酸和鞣酸呈阳性反应;醇洗脱段对3种沉淀试剂均呈阳性反应。鉴定结果表明所分离的样品为羟基取代吲哚里西啶类生物碱。[结论]内生真菌棘豆蠕孢菌具有合成与其宿主植物甘肃棘豆相同或相似活性成分的能力。     

马立克氏病病毒L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。     

p15在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白.为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15.将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定.将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72 h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL.将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%.Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达.