84个苹果栽培品种对斑点落叶病的抗性评价和全基因组关联分析

【目的】斑点落叶病是中国苹果产区发生的主要病害之一,严重影响苹果的产量和品质。本研究旨在发掘具有高抗病性的苹果栽培品种和探寻调控斑点落叶病抗性的关键基因,为苹果品种改良提供科学依据。【方法】利用苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternata f. sp. mali）对84份苹果栽培品种进行离体叶片接种鉴定,从病斑面积和病斑面积增长率两方面进行聚类分析,评价苹果栽培品种对斑点落叶病的抗性。用接种后叶片的病斑面积作为表型性状,以全基因组深度重测序获得的1 243 071个高质量SNP位点为遗传标记,采用EMMAX方法进行全基因组关联分析。【结果】84份苹果栽培品种接种后统计病斑面积发现,不同的苹果栽培品种在对斑点落叶病的抗病性方面表现出显著的多样性,其中感病和中抗的品种占绝大多数,而高抗和高感的品种占比较少;苹果斑点落叶病抗病性具有正态分布特征,呈现数量性状遗传特征。全基因组关联性状分析最终获得6个SNP位点呈现显著水平P≤0.0000001（-LgP≥7）,深入分析将其关联到7个关键候选基因,包括整合素连接蛋白激酶、FMN连锁氧化还原酶、B-box型锌指蛋白、GATA型转录因子等,并验证了整合素连接蛋白激酶在苹果抗病中的作用。【结论】经过两年数据的综合分析,最终从84个苹果栽培品种里,鉴定到稳定抗性品种7份,稳定易感品种2份。通过全基因组关联性状分析鉴定到与苹果斑点落叶病抗病性显著相关的6个SNP位点,关联到7个关键候选基因,并验证了其中一个基因的功能。     

秦冠、富士苹果杂交后代抗早期落叶病的遗传分析

采用秦冠、富士杂交F1代,对苹果早期落叶病的抗性遗传倾向进行研究。结果表明,杂交F1代斑点病的遗传倾向在不同年份表现一致,病情指数由小到大依次为秦冠×富士<富士×秦冠,而褐斑病的遗传倾向在不同组合不同年份表现不一致。秦冠、富士杂交F1代的斑点病病情指数均值略高于或低于亲中值,表明秦冠、富士杂交后代抗斑点病的遗传中加性效应较大,在后代中选择抗病单株潜力大。褐斑病病情指数均高于亲中值,表明褐斑病遗传中非加性效应占有较大比重。     

富士、秦冠苹果对早期落叶病抗性的遗传分析

为研究早期落叶病的遗传特性,对秦冠富士两个品种及其F1代叶片斑点落叶病和褐斑病发病情况进行了田间调查和比较,结果发现秦冠的抗病性明显高于富士。3个组合中,F1代斑点落叶病(Alternaria alternate f.sp.mali)和褐斑病(Marssonina mail(P.Henn)Ito)的病情指数均不符合正态分布。初步认为褐斑病和斑点落叶病的抗病基因为数量性状,但含有主效抗病基因。各组合内,每个组合中褐斑病与斑点落叶病的病情指数之间无相关关系。秦冠作母本可以显著提高杂交后代对斑点落叶病的抗病性。     

苹果抗斑点落叶病基因的一个RAPD标记的SCAR转换

将苹果抗斑点落叶病相关基因的一个RAPD标记成功转换为重复性和特异性更好的SCAR标记。由序列特点设计特异SCAR引物,并用所设计引物对两亲本和抗病、感病基因池及F1代单株进行PCR扩增。结果表明,秦冠×富士F1代群体在抗病后代个体中扩增出470 bp条带,而在感病后代个体中无此扩增条带,故将该标记命名为SCAR470。同时,分析分离群体的扩增,重复率为4.69%,表明该标记可以用于苹果斑点落叶病的分子鉴定。     

对节白蜡树叶提取物杀菌活性初步研究

【目的】研究对节白蜡的抗病原因,探寻新的生物农药。【方法】对对节白蜡树叶中的化合物质进行了分离提取,并将提取物分别对小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、棉花红腐病菌、核桃根腐病菌、马铃薯早疫病菌、苹果斑点落叶病菌进行室内生物活性测定试验,为了进一步锁定有效成分,对乙酸乙酯萃取物进行了柱层析初步分离,并进行了组分杀菌活性测定。【结果】在500μg/m L浓度下,乙酸乙酯萃取物整体表现出较好活性,其中对苹果斑点落叶病和棉花红腐病的抑制率分别达到78.0%、69.0%。组分1和组分4整体表现出优于其他组分的杀菌活性,其中组分1对棉花红腐病、苹果斑点落叶病的抑制率分别达到70.0%和79.0%,组分4苹果斑点落叶病的抑制率也达到74.0%。【结论】对节白蜡提取物对部分病菌具有一定的抑制效果,为研究对节白蜡的抗病原因打下了一定的基础。     

小麦不同品种耐湿性生理指标综合评价及其预测

 把小麦各生理指标的耐湿系数作为衡量小麦单项耐湿能力大小的指标 ,用主成分分析法将各单项耐湿系数综合成几个新的相互独立的综合指标 ,再利用隶属函数求出每一品种耐湿性的综合评价值后 ,便可较准确地评价各品种的耐湿性。同时利用耐湿性的综合评价值与单项指标间建立的最优回归方程可以预测其它小麦品种耐湿性的大小     

苹果杂交F1代抗褐斑病遗传趋势及抗性选择研究

【目的】探讨苹果抗褐斑病遗传趋势及杂种抗性选择,为苹果杂交育种的抗病性早期选择提供理论依据。【方法】以苹果品种秦冠、富士及其杂交F1代为材料,连续3年对苹果褐斑病(Marssonina coronarian(Ell.EtDavis)Davis)发生规律进行田间鉴定和调查,研究了苹果褐斑病遗传趋势及杂种抗性表现。【结果】苹果杂交F1代褐斑病病情指数表现广泛分离,呈现偏正态分布规律,苹果褐斑病是主基因控制和微效多基因共同作用的数量性状;正反交组合之间抗性差异显著,平均病情指数31.7,F1代抗病植株占49.1%,其中高抗(DI<5)单株比率为7.0%,高感(DI>50)单株比率为14.6%;不同年份间群体平均病情指数相关系数达0.78~0.85,达到显著或极显著相关,大部分植株抗性表现稳定,病害发生周期内8月底是植株个体抗性鉴定的最佳时期。【结论】苹果褐斑病遗传符合数量性状遗传规律,杂种抗性表现型丰富,早期抗性选择和淘汰能有效提高育种效率。     

苹果抗轮纹病遗传的初步研究

以筛选出的2个抗病、感病苹果品种及抗病×抗病、抗病×感病、感病×感病3类杂交组合的F1为材料,通过3年人工接种鉴定的方法,研究了F1单株间的抗轮纹病情况。结果表明,不同的杂交组合、同父本组合、同母本组合间抗病性差异显著,正反交组合之间差异不显著。试验初步筛选了抗病杂种株系150多份,对轮纹病抗性较强组合1个。     

苹果杂交F1代丰产性状综合选择模式研究

【目的】分析苹果杂交后代单株产量与单果质量、坐果率、叶面积、干粗、果实发育期、叶绿素含量、净光合速率、百叶质量之间的关联程度。【方法】以"短枝富士"和"粉红女士"多年的性状平均表现和预期育种目标为基础,制订其杂交后代主要性状的分级标准,通过对261株短枝富士与粉红女士杂交F1代单果质量、坐果率、叶面积、干粗、果实发育期、叶绿素含量、净光合速率和百叶质量等的调查,计算产量与各性状的相关程度,建立丰产性状的综合选择模式,并对该模式进行了验证。【结果】杂交后代单株产量与单果质量、坐果率、干粗、净光合速率、百叶质量显著相关;与叶面积、叶绿素含量、果实发育期相关性不显著。选取与单株产量相关性显著的5个性状,结合果树育种实际,建立了一套苹果杂交F1代丰产性状综合评价的数量化模式。【结论】丰产性状综合选择模式在苹果育种实践中具有良好的实用性。     

大花型茶专用菊杂交后代株系的综合评价与筛选

【目的】通过建立大花型茶专用菊综合评价体系,筛选出综合表现优异的株系,为大花型茶专用菊新品种选育提供理论参考和物质基础。【方法】以大花型茶专用菊品种‘金丝黄菊’的46个经田间初选的杂交后代无性株系及5个亲本为供试材料,从农艺性状、感官品质、有效成分等方面共选取花干重、舌状花数、盛花期、株高、冠幅、单株花数、干花产量、抗旱性、抗病性、干花径、干花形、干花色、香气、汤花、汤色、滋味及总黄酮、绿原酸、木犀草苷和3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量等20个性状指标作为评价因子,利用层次分析法及K-Means聚类分析法建立综合评价体系,开展杂种株系的综合筛选。【结果】通过对大花型茶专用菊F1代株系性状进行观测与分析,结果表明,较多F1代株系花期相对较晚。其抗旱能力相比‘金丝黄菊’有一定提高,抗病性综合表现一般。较多F1代株系在花部观赏性上得到了一定程度的改良,但整体上花径没有明显增加,在生长、产量指标及滋味上尚有不足。应用层次分析法确定了各性状的权重值,其中干花径权重值最大,为0.148;其次是汤花、汤色、滋味,权重值均为0.084;再次是盛花期和干花产量,权重值均为0.080。通过K-Means聚...     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系

【目的】以葡萄风信子亚美尼亚(Muscari armeniacum)的胚性愈伤组织为受体系统,建立高效稳定的葡萄风信子遗传转化体系,为葡萄风信子遗传改良及相关基因功能的研究奠定基础。【方法】通过GUS(β-葡萄糖苷酸酶)瞬时表达率,研究根癌农杆菌的菌液浓度、侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间等4个因素对葡萄风信子GUS瞬时表达效率的影响,并在最佳条件下将GUS基因转入葡萄风信子,获得稳定表达转化植株。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织GUS染色结果表明,随着根癌农杆菌菌液浓度的增加及侵染时间、共培养时间和超声波预处理时间的延长,GUS瞬时表达效率均呈现先增后降趋势;当根癌农杆菌菌液OD600为0.5、侵染时间20min、共培养4d、80W功率超声波预处理3min时,其GUS瞬时表达效率最高,分别为14.43%,13.73%,10.85%和75.36%;在最佳转化体系下将GUS基因转入葡萄风信子,获得207株潮霉素抗性植株。GUS组织化学检测结果表明:在抗性植株的不同部位都呈现不同程度的蓝色,PCR检测有7株为阳性植株,阳性率为7%;反转录PCR检测显示,7株阳性植株中有3株扩增出GUS基因目的条带。【结论】初步建立了根癌农杆菌介导的葡萄风信子遗传转化体系,该体系能显著提高葡萄风信子GUS瞬时表达效率。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

为探明长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌的作用机理,采用对峙培养、显微观察、孢子萌发、室内防效测定等方法研究其抑制能力和防治效果。结果表明：长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,对峙培养7 d时,长枝木霉T6菌株对该病菌的抑制率为60.09%;显微形态观察表明：长枝木霉T6菌株菌丝与美洲南瓜枯萎病菌菌丝发生缠绕;长枝木霉T6菌株发酵液对美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌发具有明显的抑制作用,抑制率为31.00%;长枝木霉T6菌株对美洲南瓜枯萎病具有较好的防治效果,室内盆栽防效为69.06%。     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

黄瓜YABBYs家族及CsYAB1a基因功能初探

为鉴定黄瓜YABBYs家族及对CsYAB1a基因的生物学功能进行初步探究,通过BLASTp比对鉴定黄瓜YABBYs基因,并对其进行基因、蛋白质水平分析和染色体定位,同时利用实时荧光定量和原位杂交技术检测其在黄瓜中的时空表达模式;在拟南芥中异源过表达CsYAB1a基因,对转基因株系进行表达量分析和表型观察统计;通过外源喷施脱落酸和生长素处理检测CsYAB1a基因的响应情况。结果表明:1)黄瓜YABBYs家族包含8个家族成员,所有成员均包含C2C2锌指结构域和YABBY结构域;大部分YABBYs基因在生殖器官有表达,CsYAB1a基因主要在花瓣原基和子房外果皮中富集,并呈现出远轴端表达的极性模式。2)在拟南芥中异源过表达CsYAB1a基因导致雌雄蕊发育畸形且果荚变短、叶片细长并向远轴端卷曲等表型;CsYAB1a基因调控拟南芥果实和叶片的发育,并对果实发育基因AtSPL、AtIND、AtHEC以及叶片极性基因AtAS1和AtKANs的表达量有影响。3)黄瓜YABBYs基因启动子包含5种激素响应元件,CsYAB1a和CsCRC基因对外源脱落酸和生长素喷施处理均有响应。综上,推测黄瓜YABBYs家族可能在黄瓜营养生长和生殖生长过程中发挥重要作用,且CsYAB1a基因调控黄瓜果实和叶片的发育。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。