恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株AP核酸内切酶(AP endonuclease)的功能,通过PCR的方法扩增PF3D7_0305600(292~1 137 bp),构建克隆载体。测序正确后,将该片段插入到pET-28a和p GEX-4T-1,构建重组表达载体p ET-28a-Ae、p GEX-4T-1-Ae。将表达载体转入BL21-Codon Plus表达重组蛋白r-Ae-His和r-Ae-GST,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,r-Ae-His免疫家兔制备多克隆抗体,并用ELISA检测抗血清效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明:表达的r-Ae-His分子量约为39 ku,r-Ae-GST分子量约为60 ku。制备的多克隆抗体能够特异性地识别天然蛋白,可用于恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的后续研究。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。     

牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆(Paralichthys olivaceus)M17蛋白的多克隆抗体，将M17基因插入pET-32a原核表达载体，构建M17基因原核表达质粒p ET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞，通过IPTG诱导M17蛋白表达，利用NiNTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体(抗血清)。结果显示，IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku,M17重组蛋白主要以包涵体表达为主；Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597μg·mL^-1；多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16，经Western blotting分析可见单一目的条带，说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知，M17重组蛋白表达成功，且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。     

猪丁型冠状病毒S基因的原核表达及多克隆抗体的制备

纤突（Spike, S）蛋白是猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus, PDCoV）诱导机体产生抗体的主要抗原,为制备其重组蛋白和多克隆抗体,本实验对分离株CHN/20GXNN-1/2020的S基因进行序列分析,选择抗原指数较高的b区S1b,克隆至表达载体p ET-32a进行原核表达,重组蛋白S1b主要以包涵体形式表达,大小约为34.1 k Da。利用Ni-NTA琼脂糖树脂纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。通过间接ELISA测定多克隆抗体的效价高于1∶128 000,Western blot和IFA均证明其可以与病毒S蛋白特异性结合。本研究制备的多克隆抗体特异性良好,为进一步研发PDCoV的检测方法和研究S蛋白的功能奠定了基础。     

巨型艾美耳球虫IMP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

免疫映射蛋白1(IMP1)是一种从巨型艾美耳球虫中发现的蛋白,具有良好的免疫原性和免疫保护性.本试验通过Em IMP1基因的克隆、原核表达以及多克隆抗体的制备,为后续深入研究该蛋白的生物学及免疫学功能奠定基础.首先,从未孢子化的巨型艾美耳球虫新疆株卵囊中提取总RNA,反转录合成c DNA,PCR扩增Em IMP1基因片段.其次,将Em IMP1基因扩增片段连接到原核表达载体p ET-28a构建表达质粒p ET-28a-Em IMP1,转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株并进行表达;将纯化后的蛋白与等量弗氏佐剂乳化后皮下注射至2只新西兰大白兔体内,每隔2周免疫一次,一共免疫4次后取得的兔血清即为多克隆抗体.最后,用所获得的多克隆抗体,对纯化后的Em IMP1进行免疫印迹试验鉴定,用酶联免疫吸附测定法检测多克隆抗体的效价.结果表明,克隆出的Em IMP1基因的全长为1 140 bp,诱导出的蛋白大小为70 ku,且该蛋白在上清液和包涵体中均有存在.免疫印迹试验检测结果显示,用上述方法制备的多克隆抗体具有良好的特异性,酶联免疫吸附测定法检测结果表明该多克隆抗体具有高效价.因此,可通过原核表达蛋白Em IMP1免疫兔子制备特异性好且效价高的多克隆抗体.     

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。     

尼罗罗非鱼TGF-β1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为制备尼罗罗非鱼TGF-β1多克隆抗体,采用同源重组技术构建尼罗罗非鱼pET-B2m-TGF-β1原核表达载体,转入大肠杆菌B21中诱导表达,将重组表达蛋白质纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,采用Western Blot和ELISA检测抗体的特异性和效价。结果表明,构建的pET-B2m-TGF-β1原核表达载体经诱导表达获得了分子量为5.2×10~4的重组蛋白质,免疫大耳兔获得效价为1∶2 048 000的抗尼罗罗非鱼TGF-β1多克隆抗血清,该抗体能够特异性地识别原核表达的TGF-β1蛋白。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备(英文)

[目的]为克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并鉴定。[方法]以以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,WesternΒlotting检测抗体的特异性。[结果]适构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可以高效表达NrfA蛋白,免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1:204900,经WesternBlotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,构建了表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

尼罗罗非鱼PPARδ的原核表达及其多抗制备和纯化

【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2 048 000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pCold Ⅱ载体上,构建pCold Ⅱ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pCold Ⅱ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24 h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

鹅源新城疫病毒M基因的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。     

单增李斯特菌Hly基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得单增李斯特菌溶血素(Listeriolysiono,LLO)蛋白及其多克隆抗体。根据单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计了一对特异性引物,扩增出Hly基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,并转化于大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的作用下重组LLO蛋白成功表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量约为69.3 ku,且主要以包涵体形式表达LLO蛋白。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗LLO抗体。Western-blot检测到一条约69.3 ku的特异性条带,表明该抗体具有较强的特异性。单增李斯特菌溶血素基因Hly在大肠杆菌中已成功表达,且制备的多克隆抗体可用于LLO蛋白的检测。     

鸡氨肽酶N蛋白多克隆抗体制备及其生物学功能研究

试验参考Gen Bank上鸡氨肽酶N(g APN)基因序列(登录号为NM_204861.1)设计多对特异性引物,利用RT-PCR分段克隆g APN基因各段克隆产物并利用SOE-PCR将其进行连接,得到大小为2 906 bp的全长基因。利用原核表达载体p ET-30a(+)构建重组质粒p ET-g APN并转化E.coli Rosetta,经诱导表达得到大小为113 ku目的条带。以纯化g APN重组蛋白为免疫原制备兔抗g APN多克隆抗体,间接Elisa方法检测多抗血清效价为215。Western Blot试验证明,此多克隆抗体可以与原核表达的蛋白产生特异性条带,同时与18日龄鸡肾组织中获得的天然g APN蛋白样品有良好的反应性。间接免疫荧光试验显示,多克隆抗体可检测到pc DNA-g APN转染HELA细胞所表达的g APN蛋白。上述结果可为g APN蛋白的深入研究奠定基础。     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。     

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据已经发表的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因序列,设计1对特异性引物(上下游分别插入Bam H I和Sac I酶切位点),利用PCR技术扩增出VP1基因,经Bam H I和Sac I双酶切后,将其克隆至原核表达载体p ET-32a上,获得重组表达质粒p ET-VP1。重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),重组蛋白经IPTG诱导成功表达。将重组蛋白切胶免疫6周龄的BALB/c小鼠,3次免疫后采血,制备DHV-Ⅰ的多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,成功表达出的重组蛋白分子量约为46 000。Western-blotting分析结果表明,该重组蛋白可与His组氨酸鼠单克隆抗体发生特异性反应,Western-blotting检测抗鼠DHV多抗的结果显示,DHV多抗能与目的蛋白发生特异性反应。以上结果表明,DHV的VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的DHV多抗能用于VP1蛋白表达的检测。