太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

饲料中添加壳寡糖对刺参肠壁菌群的影响

为研究饲料中添加壳寡糖对刺参Apostichopus japonicus肠壁菌群的影响,在刺参基础饲料中分别添加0.25%(G1)、0.50%(G2)、0.75%(G3)和1.00%(G4)的壳寡糖,另设对照组(G0),养殖50 d后采集各组刺参幼参(5.03 g±0.03 g)肠壁样品,并采用高通量测序技术分析刺参肠壁菌群结构特征。结果表明:壳寡糖添加组刺参肠壁的细菌多样性和丰度均高于对照组;各组样品肠壁优势菌门均为变形菌门和厚壁菌门;壳寡糖对刺参肠壁菌群组成产生了明显影响,对照组优势菌属为希瓦氏菌属Shewanella,而壳寡糖添加组希瓦氏菌属的相对比例均下降,对照组芽孢杆菌属Bacillus的相对比例较低,而壳寡糖添加组芽孢杆菌属的相对比例均较高或成为优势菌属;1.00%壳寡糖组各类菌属相对比例均较低,高浓度壳寡糖出现抑制现象。研究表明,饲料中添加壳寡糖可提高刺参肠壁细菌多样性和丰度,明显改善刺参肠壁菌群结构。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

急性低盐胁迫下红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1和Hsp70基因的表达

为探讨红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)耐低盐的分子机制,以自然海水组为对照,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析红鳍东方鲀幼鱼在盐度16、12、8和4胁迫下,鳃和肾中免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、钠钾氯协同转运蛋白1(Na-K-Cl cotransporter 1,NKCC1)和热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)3个基因的表达情况。结果表明,3个基因在鳃和肾中均有表达,IgM和Hsp70基因在鳃和肾中的表达量均无显著性差异(P0.05),而NKCC1基因在鳃中的表达量显著高于肾(P0.05)。同一盐度下,随着时间的增加,鳃中IgM基因的表达量大致呈现先降低后升高的趋势,肾中则呈现先降低后升高再趋于平稳的趋势;同一时间内,鳃中低盐度组与对照组的IgM基因表达量差异比肾中差异更为明显。在鳃中,相同时间内NKCC1基因在各低盐度组的表达量低于对照组,尤其在6h和72h两个时间点时显著低于对照组(P0.05);肾中各时间点的表达量基本都高于0h表达量。在相同时间内,3h、6h、24h、72h的各低盐度组,在鳃中,Hsp70基因的表达量均与同一时间对照组之间差异明显(P0.05);在肾中,从6h开始,各低盐组与对照组之间差异性显著(P0.05)。以上结果表明,红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1、Hsp70 3个基因的表达量在不同盐度不同时间下存在差异,由此推测这3个基因对红鳍东方鲀幼鱼的渗透压调节起重要作用。