太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

大头鳕TNFSF6基因的结构分析及其在发育早期和病毒暴发时的表达水平

为揭示大头鳕TNFSF6基因的基本结构与功能及其在大头鳕发育和神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus, PCNNV)暴发时的响应机制,本研究通过基因克隆获得TNFSF6 cDNA开放阅读框序列,并对序列进行生物信息学分析,运用相对荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对TNFSF6在不同组织、孵化后不同日龄仔鱼和PCNNV感染前后仔稚鱼中的表达水平进行检测。结果显示,大头鳕TNFSF6 cDNA长1 388 bp,5′UTR占315bp,3′UTR占500 bp,ORF全长573 bp,编码190个氨基酸。qRT-PCR结果显示,TNFSF6在各组织均有表达,但在脾脏和鳃组织中的表达量较高;大头鳕孵化后15、20、37和40 d TNFSF6基因的转录水平分别是其在5 d转录水平的0.28、0.15、0.12和0.13倍。在24 d和46 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6基因的转录水平高于对照组;在77 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6转录水平则显著低于对照组。研究表明,TNFSF6基因在大头鳕发育早期和仔鱼暴发PCNNV时发挥了重要的作用。     

太平洋鳕IRF3 基因的克隆及绝对定量表达分析

本研究通过克隆首次得到太平洋鳕(Gadus macrocephalus)干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的部分序列。该序列长1878 bp,包含长1377 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码459个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为51 k D。经氨基酸序列比对发现,太平洋鳕IRF3的氨基酸序列包括1个含有5个保守色氨酸残基的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和1个保守的C端IRF关联域(IRF association domain,IAD);系统进化树分析表明,太平洋鳕IRF3与其他物种的IRF3亲缘关系较近。应用绝对荧光定量PCR方法对IRF3在不同组织和不同日龄(days post-hatching,dph)仔鱼的表达水平进行检测,并对干扰素在仔鱼期的免疫作用进行分析。组织表达绝对定量结果显示,性腺,肝和胸腺表达量高于其他组织。不同日龄仔鱼IRF3表达量结果显示,IRF3在受精卵就已经表达,在25 dph表达量大幅提高。本研究的结果为进一步研究太平洋鳕干扰素作用机制以及其在早期发育中的作用奠定了基础。     

重组激活基因(RAGs)功能机制及其在鱼类早期发育中的作用

在B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育过程中, BCR和TCR基因座(Igκ、Igλ、Igh、Tcrα、Tcrβ、Tcrγ、Tcrδ)的可变区(V)、多样区(D)、链接区(J)发生V(D)J重排, 该重排过程是在重组激活蛋白(RAG-1和RAG-2)的作用下完成的, V(D)J重排机制使机体拥有庞大的抗体库, 以应对自然界中多元的病原微生物。RAGs结构分为核心区和非核心区, 核心区域发挥着重要的基因片段酶切功能, 而非核心区域的九聚体序列(nonamer)、锌指等结构具有调节V(D)J重排的功能。RAGs的功能在转录水平、染色体水平以及蛋白水平受到严格的时间和空间调控, 以保证B/T细胞的正常发育。随着国内外学者对哺乳动物RAGs基因的结构与功能机制的深入研究, RAGs也在淡水鱼和海水鱼中有了越来越多的报道。由于RAGs的功能特点以及在进化过程中的稳定性, 其已成为研究鱼类免疫系统发育过程和系统进化的重要分子标记。本文在赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) RAGs研究的基础上探讨了RAGs定位鱼类免疫系统的发生过程, 旨在为鱼类人工繁殖技术的突破、鱼类疫苗的开发与研制以及鱼类免疫学研究等提供理论借鉴。

     

植酸酶对红鳍东方鲀幼鱼生长、消化酶及消化率的影响

以初始体质量为(4.58±0.05)g的红鳍东方鲀Takifugu rubripes幼鱼为对象,进行为期60 d的饲养试验,研究植酸酶对红鳍东方鲀幼鱼生长、消化酶、消化率的影响。试验设6组:对照组D1,全鱼粉蛋白组;对照组D2,以豆粕替代30%鱼粉蛋白组;试验组S1～S4,在豆粕替代30%鱼粉蛋白基础上设4个不同的植酸酶添加水平(500、1 000、1 500、2 000 U/kg),每个组设3个重复。结果表明:各组幼鱼成活率没有显著差异(P>0.05);D1组幼鱼各项生长指标均最优,D2组幼鱼生长性能指标较D1组显著降低(P<0.05);添加植酸酶后,试验组幼鱼的生长状况得到一定程度的改善,添加植酸酶≥1 000 U/kg时,幼鱼的终末体质量、特定生长率较D2组明显提高(P<0.05),饵料系数较D2组显著降低(P<0.05);添加植酸酶能提高幼鱼肠道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力;植酸酶一定程度上能提高干物质的消化率,但不明显(P>0.05);添加1 000 U/kg植酸酶时,幼鱼的蛋白表观消化率达到最高;添加1 000、1 500 U/kg植酸酶时,能显著提高幼鱼的脂肪消化率(P<0.05);添加植酸酶后,幼鱼的磷消化率较D2组显著升高(P<0.05)。研究结果表明,在本试验条件下,饲料中添加植酸酶可以促进红鳍东方鲀幼鱼生长、改善消化,建议饲料中植酸酶的适宜添加量为1 000～1 500 U/kg。     

聚肌胞对雏鸡新城疫抗体水平的影响

为研究聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic acid,PolyI:C)对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响,在肉仔鸡7日龄免疫的前后注射PolyI:C,并测定各处理组中雏鸡血清抗体水平.结果显示,免疫之前48、24和12h注射Polyl:C,雏鸡血液中抗体效价仅在10日龄明显升高;免疫新城疫疫苗的同时及免疫之后12、24h注射PolyI:C,9～12日龄雏鸡血清抗体滴度均明显提高.PolyI:C可以提高雏鸡免疫抗体滴度,对由弱毒苗刺激的免疫反应具有调理作用.     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

太平洋鳕RAG1和IgM基因荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和IgM基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点.根据GenBank中RAG1和IgM的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和IgM的基因片段.将所获基因片段分别插入到克隆载体pMD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和IgM基因的质粒标准品.建立并优化太平洋鳕RAG1和IgM基因绝对荧光定量PCR方法.为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异.以优化后的绝对荧光定量PCR方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和IgM的表达情况.结果显示,RAG1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数R2=0.996;IgM的回归方程为y=-3.119x +27.61,回归系数R2 =0.998.绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即RAG1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;IgM基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾.RAG1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(days posthatching,dph)至95 dph表达量显著提高;IgM基因在早期表达水平同样很低,到33 dph至61 dph才有明显表达,在95 dph时表达量显著提高.研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测.     

温度和金属离子对干扰素诱导剂 聚肌胞配对的影响

为提高聚肌胞（Polyinosinic-polycytidylic acid，polyI：C）的配对效果，本文研究了温度和金属离子对聚肌胞配对的影响。实验结果显示，在45℃条件下合成的聚肌胞减色效应最强，说明在该温度下聚肌苷酸（Polyinosinic acid，PI）和聚胞苷酸（Polycytidylic acid，PC）配对最紧密；Na^＋、Ca^2＋、Mg^2＋、Mn^2＋和Zn^2＋能够增强聚肌胞双链结构的紧密性，当Na^＋浓度增加到0．085mol／L后，聚肌胞的配对接近饱和；Ca^2＋、Mg^2＋、Mn^2＋和Zn^2＋对聚肌胞结构的保护效果基本一致，而Cu^2＋对聚肌胞结构具有明显破坏作用。建议采用45℃合成聚肌胞并添加适当浓度的Na^＋和Ca^2＋等增强其结构的紧密性，以避免机体内高活性RNA酶的降解而失去药效。