太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

大头鳕TNFSF6基因的结构分析及其在发育早期和病毒暴发时的表达水平

为揭示大头鳕TNFSF6基因的基本结构与功能及其在大头鳕发育和神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus, PCNNV)暴发时的响应机制,本研究通过基因克隆获得TNFSF6 cDNA开放阅读框序列,并对序列进行生物信息学分析,运用相对荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对TNFSF6在不同组织、孵化后不同日龄仔鱼和PCNNV感染前后仔稚鱼中的表达水平进行检测。结果显示,大头鳕TNFSF6 cDNA长1 388 bp,5′UTR占315bp,3′UTR占500 bp,ORF全长573 bp,编码190个氨基酸。qRT-PCR结果显示,TNFSF6在各组织均有表达,但在脾脏和鳃组织中的表达量较高;大头鳕孵化后15、20、37和40 d TNFSF6基因的转录水平分别是其在5 d转录水平的0.28、0.15、0.12和0.13倍。在24 d和46 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6基因的转录水平高于对照组;在77 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6转录水平则显著低于对照组。研究表明,TNFSF6基因在大头鳕发育早期和仔鱼暴发PCNNV时发挥了重要的作用。     

太平洋鳕IRF3 基因的克隆及绝对定量表达分析

本研究通过克隆首次得到太平洋鳕(Gadus macrocephalus)干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的部分序列。该序列长1878 bp,包含长1377 bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码459个氨基酸,其编码的蛋白质分子量约为51 k D。经氨基酸序列比对发现,太平洋鳕IRF3的氨基酸序列包括1个含有5个保守色氨酸残基的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和1个保守的C端IRF关联域(IRF association domain,IAD);系统进化树分析表明,太平洋鳕IRF3与其他物种的IRF3亲缘关系较近。应用绝对荧光定量PCR方法对IRF3在不同组织和不同日龄(days post-hatching,dph)仔鱼的表达水平进行检测,并对干扰素在仔鱼期的免疫作用进行分析。组织表达绝对定量结果显示,性腺,肝和胸腺表达量高于其他组织。不同日龄仔鱼IRF3表达量结果显示,IRF3在受精卵就已经表达,在25 dph表达量大幅提高。本研究的结果为进一步研究太平洋鳕干扰素作用机制以及其在早期发育中的作用奠定了基础。     

鱼类学实验课程教学改革与实践

为提高鱼类学实验课教学质量,根据大连海洋大学水产与生命学:鱼类学实验课教学历史和水产养殖学专业特点,从实验内容、教学方法等方面进行了改革与实践,并具体介绍了改革后鱼类学实验的3个阶段,即基础阶段、应用阶段及综合阶段。     

不同温度下充氧包装的活品海湾扇贝品质变化

为延长海湾扇贝贮运过程中的存活期并保证其品质,将海湾扇贝平铺放入HDPE材质的包装袋(32 cm×25 cm),并充入体积分数为99.9%的氧气,密封后将充氧包装的海湾扇贝分别置于0、5、10、15℃4个不同温度下,探讨不同温度对其品质的影响。试验结果显示,密封充氧包装的海湾扇贝较低温条件下的存活率、感官评价分值和糖原明显高于同一时间的较高温条件,同时较高温条件下质量损失率、色度差、细菌总数上升速度均高于较低温条件。其中,0℃条件下无水保活效果最好,11 d出现死亡,15 d全部死亡。首次出现死亡时间比5、10、15℃组分别延长5、7、9 d;全部死亡时间比5、10、15℃组分别延长4、5、9 d。0℃条件下,其感官评价分值在0～4 d内接近满分,颜色变化最小,其色度差为3.98。综合各项指标变化,0℃条件下有利于延长充氧包装内海湾扇贝的保活时间,有效保持海湾扇贝活品品质。研究结果为活品海湾扇贝密封充氧保活保鲜技术提供数据参考。     

低盐胁迫对红鳍东方鲀幼鱼肝脏的酶活性、组织结构及免疫基因表达的影响

为探讨低盐胁迫下肝脏在红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)机体免疫中的作用,在肝脏酶活性、组织结构和基因表达水平3个方面进行了研究。结果表明,低盐(盐度4‰)胁迫下红鳍东方鲀肝脏中总超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)的酶活性显著高于对照组(P0.05);肝脏组织结构中肝细胞发生肿大,形状变形;肝脏IL15和TLR3基因的表达量显著升高(P0.05),而IRF2基因的表达量却未有显著性差异(P0.05)。     

太平洋鳕RAG1和IgM基因荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为研究太平洋鳕发育早期特异免疫系统形成的机制,通过RAG1和IgM基因的转录水平衡量特异免疫系统的发育特点.根据GenBank中RAG1和IgM的序列信息,分别设计1对特异引物,从太平洋鳕头肾中扩增得到RAG1和IgM的基因片段.将所获基因片段分别插入到克隆载体pMD18-T中,从而构建太平洋鳕RAG1和IgM基因的质粒标准品.建立并优化太平洋鳕RAG1和IgM基因绝对荧光定量PCR方法.为进一步验证该方法的可靠性,分别利用绝对定量和相对定量检验目的基因在太平洋鳕早期发育过程不同组织内的表达差异.以优化后的绝对荧光定量PCR方法检测不同发育时期太平洋鳕RAG1和IgM的表达情况.结果显示,RAG1的回归方程为y=-3.266x+33.77,回归系数R2=0.996;IgM的回归方程为y=-3.119x +27.61,回归系数R2 =0.998.绝对定量和相对定量结果在基因转录趋势上显现出一致性,即RAG1基因在胸腺和头肾中表达,且在胸腺中的表达量显著高于头肾中的表达量,在肝脏和脾脏中无表达;IgM基因在胸腺、头肾、肝脏和脾脏中均有表达,其中脾脏中表达量最高,其次是头肾.RAG1基因在太平洋鳕发育早期的表达水平很低,到61日龄(days posthatching,dph)至95 dph表达量显著提高;IgM基因在早期表达水平同样很低,到33 dph至61 dph才有明显表达,在95 dph时表达量显著提高.研究表明,本实验方法可靠,特异性较强,可成功对目标基因转录水平进行检测.     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

急性低盐胁迫下红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1和Hsp70基因的表达

为探讨红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)耐低盐的分子机制,以自然海水组为对照,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析红鳍东方鲀幼鱼在盐度16、12、8和4胁迫下,鳃和肾中免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、钠钾氯协同转运蛋白1(Na-K-Cl cotransporter 1,NKCC1)和热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)3个基因的表达情况。结果表明,3个基因在鳃和肾中均有表达,IgM和Hsp70基因在鳃和肾中的表达量均无显著性差异(P0.05),而NKCC1基因在鳃中的表达量显著高于肾(P0.05)。同一盐度下,随着时间的增加,鳃中IgM基因的表达量大致呈现先降低后升高的趋势,肾中则呈现先降低后升高再趋于平稳的趋势;同一时间内,鳃中低盐度组与对照组的IgM基因表达量差异比肾中差异更为明显。在鳃中,相同时间内NKCC1基因在各低盐度组的表达量低于对照组,尤其在6h和72h两个时间点时显著低于对照组(P0.05);肾中各时间点的表达量基本都高于0h表达量。在相同时间内,3h、6h、24h、72h的各低盐度组,在鳃中,Hsp70基因的表达量均与同一时间对照组之间差异明显(P0.05);在肾中,从6h开始,各低盐组与对照组之间差异性显著(P0.05)。以上结果表明,红鳍东方鲀幼鱼IgM、NKCC1、Hsp70 3个基因的表达量在不同盐度不同时间下存在差异,由此推测这3个基因对红鳍东方鲀幼鱼的渗透压调节起重要作用。