羊口疮病毒重庆分离株008基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】研究羊口疮病毒008蛋白的功能,用原核表达系统表达008基因,并对其进行生物信息学分析。【方法】通过重庆临床分离株扩增得到008基因片段,将其连接到pET-28a(+)载体上,构建重组表达质粒,诱导表达该蛋白;对008蛋白利用ProtScale程序分析疏水性,TMHMM server v.2.0分析跨膜区,SignalP 5.0 server预测信号肽以及通过Protean进行B细胞抗原表位预测分析。【结果】羊口疮008基因可以在E.coli中表达,重组蛋白分子量大小约为56 kd,主要以包涵体形式表达且与阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性。生物信息学研究显示,008蛋白属于疏水性蛋白,无跨膜区及信号肽区域,其中B细胞表位可能存在11个。【结论】构建的pET-28a(+)-008质粒在IPTG诱导下成功表达008蛋白,008蛋白具有良好的抗原性。     

鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆与原核表达

【目的】克隆鸡白痢沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因并进行原核表达,分析重组蛋白invA的抗原性,为沙门氏菌快速诊断试纸条和新型表位疫苗的研发提供理论依据。【方法】以鸡白痢沙门氏菌野毒株为供试菌,克隆其invA基因,对invA基因编码的蛋白进行生物信息学分析。将invA基因克隆到pET-30a原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a-invA,将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,检测其目的蛋白的表达情况和免疫反应特性。【结果】成功获得了1 143bp的完整的invA基因,编码381个氨基酸。生物信息学分析结果表明,invA基因编码的蛋白有17个抗原决定簇,其跨膜区域明显,92-105位氨基酸为low complexity典型结构域。构建获得了原核重组表达质粒pET-30a-invA,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了约51ku的invA融合蛋白;Western-blot检测结果显示,该融合蛋白具有良好的免疫反应性。【结论】成功克隆出了1 143bp大小invA基因,明确了其编码蛋白的生物信息,其诱导表达后获得免疫反应性良好的重组蛋白。     

鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达及纯化

对鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白FliC的基因进行克隆、鉴定和原核表达,为鞭毛蛋白佐剂作用的研究奠定基础。以鼠伤寒沙门氏菌8014菌株基因组DNA为模板,PCR扩增Flic基因,产物与T载体连接,经测序鉴定正确后与表达载体pQE30(+)连接构建重组表达质粒Flic-pQE30,将此重组质粒转化入表达宿主E.coli XL1-Blue菌株内抽提质粒,酶切鉴定正确后对转化菌株以IPTG进行诱导后,表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。测序结果显示,FliC为完整的编码区基因1 485 bp,编码495个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为56 kDa。经SDS-PAGE分析表明,以37℃、1 mM的IPTG诱导5 h,表达效果最好,诱导产物是与理论值相符的56 kDa的融合蛋白。经western-blotting检测,表达的重组蛋白FliC可与小鼠抗鼠伤寒沙门氏菌全菌体多抗血清反应得到清晰的目的条带,表明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。成功进行了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白Flic基因的克隆表达,为进一步研究其免疫佐剂作用奠定了基础。     

维氏气单胞菌AcrV基因的克隆与原核表达

【目的】克隆维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）低钙反应蛋白（AcrV）并进行原核表达,为进一步研究AcrV蛋白的结构功能及AcrV基因工程亚单位疫苗的制备奠定基础。【方法】克隆维氏气单胞菌TH0426菌株AcrV基因,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级结构及三级结构。将AcrV基因克隆到pET-30a(+)原核表达载体上,构建原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,进行EcoR Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切鉴定和测序鉴定。用IPTG对 pET-30a(+)-AcrV进行诱导表达,对IPTG浓度（0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L）和诱导时间（2,3,4和5 h）进行优化。在最佳条件下诱导表达重组蛋白AcrV,经镍柱纯化且尿素梯度复性后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,进行SDS-PAGE及Western blot分析,对目的蛋白的免疫原性进行检测。【结果】成功获得了1 086 bp的AcrV全基因,编码361个氨基酸。AcrV蛋白是无跨膜结构且不编码信号肽的蛋白,有2个高度保守的结构功能域,属于全α型蛋白。成功构建了原核重组表达质粒pET-30a(+)-AcrV,其最佳诱导表达条件为IPTG 0.8 mmol/L诱导5 h。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,AcrV蛋白能被鼠抗阳性血清识别,表明其具有一定的反应原性。【结论】成功克隆了1 086 bp的AcrV基因,分析了其编码蛋白的生物信息;获得了免疫原性良好的重组AcrV蛋白。     

丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建

【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因(SmC4H)的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。     

鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测#br#

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Western blot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStar Protean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20-Leu25、Ser40-Met47、Leu68-Ile78、Val124-Phe128、Ile129-Tyr134、Asp176-Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Western blot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Western blot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。     

非洲猪瘟病毒 CP204L 基因的生物信息学分析、载体构建及蛋白表达

【目的】非洲猪瘟病(African swine fever,ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)导致的,能引起猪高度致死的急性传染病。采用生物学手段制备检测试剂能更快、更有效地监测疫情,对ASF疫情的防控尤为重要。【方法】根据ASFV的CP204L基因CDS区序列设计特异性引物并进行PCR扩增,将目的基因片段与p EASY-T5连接构建克隆载体,利用生物信息学软件对蛋白进行生物信息学分析,用T_4连接酶构建重组载体pET-32a(+)-CP204L,将成功构建的重组表达载体质粒转入感受态Rosetta(DE3)中,用1 mmol/L IPTG、37 ℃诱导表达8 h后进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达。【结果】生物信息学分析结果表明,P30蛋白是一种主要由无规卷曲α螺旋和β折叠组成的亲水和稳定蛋白,PCR扩增及测序比对结果证明成功构建了重组表达载体,SDS-PAGE电泳验证了在24.3 ku处有潜在的P30蛋白表达。【结论】通过生物信息学软件在分子层面分析了P30蛋白的理化性质及蛋白结构,P30蛋白的表达为制备ASFV血清学诊断试剂及诊断技术奠定了基础。     

跨膜转导肽TAT、9R和牛Sox2融合蛋白原核表达载体的构建与表达研究

【目的】构建pTAT-bSox2-9R融合表达载体,并对其进行原核表达研究,为利用TAT和多聚精氨酸(9R)的跨膜作用实现转录因子蛋白直接重编程牛体细胞提供科学资料。【方法】以GenBank上公布的牛Sox2基因编码区序列为基础,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物;利用PCR扩增方法获得包括Sox2、TAT和9R的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pTAT-HA上,从而构建pTAT-HA-bSox2-9R重组表达载体;将经酶切鉴定和测序验证后的重组表达载体转化大肠杆菌,在不同IPTG浓度和诱导时间等条件下进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。【结果】成功获得bSox2-9R重组序列,成功构建重组质粒pTATbSox2-9R;pTAT-bSox2-9R在0.6mmo/L的IPTG于37℃诱导4h的条件下表达目的蛋白约36ku,经Western blot验证为目的蛋白。【结论】成功获得了pTAT-bSox2-9R融合蛋白,为多聚精氨酸蛋白转导域(PTD)介导的转录因子蛋白直接重编程黄牛体细胞以获得诱导多潜能干细胞的研究积累了原始资料。     

鸭肠炎病毒UL53截段基因的序列特性、原核表达与其抗原性检测

【目的】通过选取DEV-UL53基因主要抗原域与进行DEV-UL53截段基因B细胞表位多参数预测相结合的策略,高效表达DEV-UL53截段基因,并通过Westernblot分析重组蛋白的免疫原性。【方法】通过生物信息学软件DNAStarProtean模块对UL53基因编码的gK蛋白进行主要抗原域预测,选取主要抗原域对应的UL53截段基因进行二级结构、蛋白质骨架柔性区域、表面可及性区域预测和在线预测该蛋白的亲水性及跨膜区,并对UL53截段基因进行克隆、亚克隆、原核表达与抗原性分析。【结果】UL53截段基因编码蛋白gK的B细胞表位最可能分布于Ala20—Leu25、Ser40—Met47、Leu68—Ile78、Val124—Phe128、Ile129—Tyr134、Asp176—Ile178,构建的阳性表达质粒转入BL21表达宿主菌经IPTG诱导外源基因获得了良好表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性。【结论】实现了UL53截段基因的高效表达,经Westernblot分析表明该重组蛋白具备良好的免疫原性,这为DEV-UL53基因及其编码的蛋白gK功能的深入研究、新型疫苗和诊断试剂的研制及开发等提供可用的试验材料。     

猪IL-18基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。     

苋菜AtrADH2基因克隆及表达分析

ADH基因在甜菜色素合成酪过程氨酸途径中发挥着重要作用,为探究苋菜酪氨酸途径的关键基因AtrADH2在苋菜中的功能,本研究以'苏苋1号'苏苋2号'苋菜品种为试验材料,利用RT-PCR技术等研究方法克隆获得1个AtrADH2基因(GenBank登录号:MT982371).结果表明:1)苋菜AtrADH2基因的ORF长为...