土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取

建立了一种土壤DNA提取方法。根据DNA产量和纯度2个评价指标,从3种手提土壤DNA方法中优选出方法B为手提DNA方法（Lab method）,它包括样品预处理,细胞裂解,粗DNA纯化,其中细胞裂解组合了玻璃珠击打．SDS裂解,溶菌酶裂解。进一步应用PCR-限制性片段长度多性（Restriction fragmentlength polymorphism,RFLP）技术及PCR-温度梯度凝胶电泳（Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE）技术．结合DNA产量、纯度、片段大小以及所反映的微生物群落结构特性等指标评价了手提方法（Labmethod）得到的总DNA质量,并将这些结果与2种应用较广的商业试剂盒（Mo Bio UhraClean Soil DNA Kit和Bio 101 FastDNA SPIN Kit（For Soil1）所得DNA的各种指标进行了比较。结果表明,手提方法（Labmethod）的粗DNA产量低于Bio 101 Kit的,但高于Mo Bio Kit的。这些方法所得DNA的长度都在21kb左右,Labmethod提取的DNA没有严重被剪切现象,而2种试剂盒提取的DNA都有不同程度的剪切。手提方法得到的DNA经纯化后,应用细菌及真菌特异引物进行PCR扩增,均能获得目的片段,表明该方法能从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组DNA。并且,手提方法所得DNA的细菌16SrDNA和真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱与两种商业试剂盒的图谱基本相似,但3种方法提取的DNA在细菌16S rDNAV3区和真菌28SrDNA片段的PCR-TGGE图谱上都存在一定差异．主要表现在一些弱势条带的有无或强弱上。这说明手提方法提取的总DNA与2种商业试剂盒一样,在一定程度上能反映微生物群落的多样性和组成。总之,手提DNA方法（Lab method）所用试剂普通,价格便宜,能在4h以内获得够质够量的土壤DNA用于微生物分子生态学研究,较适合于广大普通实验室进行土壤DNA提取工作。     

荧光定量PCR检测猪肝中猪链球菌2型的基因组DNA提取方法的比较

[目的]在人工布菌猪肝中评估溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法提取猪链球菌2型基因组DNA在荧光定量检测中的应用效果,为猪链球菌2型的荧光定量检测选择合理的基因组DNA提取方法提供试验依据。[方法]采用溶菌酶-苯酚法和柱式纯化试剂盒法分别提取人工布菌猪肝样本中猪链球菌2型基因组DNA,通过荧光定量PCR技术检测猪链球菌2型的相对含量。[结果]利用荧光定量方法能够检测到猪链球菌2型。该方法可以最低检测到12 CFU/g的猪链球菌,特异性良好,标准曲线方程为y=-3.185 9x+39.901 0。在人工布菌猪肝样本中,溶菌酶-苯酚法在q PCR实验中检测猪链球菌2型较灵敏。[结论]溶菌酶-苯酚法在猪肝样品中提取基因组DNA效果较好;试剂盒法在细菌纯培养物中提取基因组DNA具有安全、高效等优点。     

几种动物生鲜肌肉组织样品DNA提取方法的比较研究

比较不同提取原理的试剂盒对动物生鲜肌肉组织DNA提取效果,为日常肉制品掺假检测与监测选择合适的DNA提取方法提供参考。以生鲜牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉为试验材料,采用改良CTAB法、蛋白酶K法、SDS法和快速萃取法等原理的8种不同方法来提取组织样品DNA,并对提取DNA的完整性、浓度、纯度、试验耗时和后续实时荧光定量PCR检测等指标进行评价。结果表明,8种提取方法均可用于常见动物源性肌肉DNA的提取。与改良CTAB法相比,原理为蛋白酶K法、SDS法和快速萃取法的试剂盒避免了有机试剂的使用,且操作耗时短。实际操作中,可优先选择基于蛋白酶K法和SDS法的试剂盒进行DNA提取,其提取的DNA纯度和总量高,盐残留少,对实时荧光定量PCR的抑制少,满足肉制品掺假检测与监测的核酸提取需求。     

高效提取肠道菌群总DNA方法的建立

[目的]建立一种高效快速的提取肠道茵群总DNA的方法,即改进的氯仿抽提法,为进一步对肠道茵群的定性和定量提供基础。[方法]通过对多种肠道菌群总DNA提取方法的考察总结,对氯仿抽提法进行改进,采用细菌添加试验的荧光实时PCR检测抽提结果,同时与QIAamp DNA Stool Mini kit法进行比较,以验证所建立的改进的氯仿抽提法的高效性。[结果]改进的氯仿抽提法提取的肠道茵群总DNA量约是QIAamp DNA Stool Mini kit的100倍;同时细菌添加试验的实时荧光定量PCR结果显示,改进的氯仿抽提法提取添加细菌的DNA效率较高。[结论]改进的氯仿抽提法经济、高效、快速,适合大批量的粪便样品的DNA提取。     

新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究

[目的]寻找一种有效的泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法。[方法]分别采用CTAB法、SDS加酶法、实验室改进法、试剂盒法提取泥火山土壤宏基因组,比较4种方法的提取效果。[结果]试剂盒法的提取效率最高、纯度最好;实验室改进法次之;SDS加酶法提取量最多。实验室改进法获得的DNA稀释10倍可直接用于PCR扩增。[结论]从经济和DNA质量的角度考虑,实验室改进法可作为新疆泥火山土壤宏基因组DNA提取最有效的方法。     

新疆泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法研究（摘要）

[目的]寻找一种有效的泥火山土壤宏基因组DNA的提取方法。[方法]分别采用CTAB法、SDS加酶法、实验室改进法、试剂盒法提取泥火山土壤宏基因组,比较4种方法的提取效果。[结果]试剂盒法的提取效率最高、纯度最好;实验室改进法次之;SDS加酶法提取量最多。实验室改进法获得的DNA,稀释10倍可直接用于PCR扩增。[结论]从经济和DNA质量的角度考虑,实验室改进法可作为新疆泥火山土壤宏基因组DNA提取最有效的方法。     

三种试剂盒提取粪便隐孢子虫微量DNA的效果比较

[目的]筛选一种高效、简单、快速、价格合理的粪便微量DNA提取试剂盒。[方法]用3种不同的试剂盒提取粪便DNA,通过比较所提取DNA的浓度、纯度、提取率及巢式PCR产物等评价提取效果。[结果]Genmed试剂盒提取的DNA浓度最高、PCR产物条带最亮,但提取时间相对较长,成本相对较高。天根试剂盒提取的DNA纯度最高,DNA浓度适中,成本适中,提取时间最短。碧云天试剂盒提取的DNA纯度、浓度均不高且提取时间最长,但成本最低。[结论]Genmed试剂盒提取粪便微量DNA最灵敏。天根试剂盒提取DNA适于DNA纯度要求较高的分子生物学研究。     

利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪场中感染猪肺炎支原体研究(英文)

[目的]2012年3月至12月从江苏泰州某猪场采集303份鼻拭子样品,利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪肺炎支原体的感染情况。[方法]采集7、14、21、28、30和35日龄的猪的鼻拭子,4℃浸泡于PBS过夜,TIANamp?细菌DNA提取试剂盒提取DNA。然后进行Mhp183的荧光定量PCR及P36的巢式PCR检测。[结果]通过巢式PCR检测,12.5%(38/303)份样品为猪肺炎支原体阳性,用荧光定量PCR检测,50.2%(152/303)的样品为阳性。两种方法检测均为阳性的样品为22份,占7.3%,两种方法检测均为阴性的样品为127份,占41.9%。两种检测方法的感染模式相同,均在7日龄和35日龄的小猪中感染率最高,巢式PCR的感染率分别为15.6%和18.4%,荧光定量PCR的感染率分别为53.1%和56.6%。[结论]两种PCR方法均适用于猪场感染状态的检测。     

羊蹄GAPDH基因的克隆及序列分析

为利用实时荧光定量PCR技术研究中草药羊蹄有效化学成分合成相关基因表达情况,采用针对多糖、多酚植物样品的总RNA提取试剂提取高质量的羊蹄总RNA,随后运用反转录PCR方法克隆了羊蹄甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因的部分c DNA序列,并以该序列为模板设计引物,采用实时荧光定量PCR验证其作为内源参照基因的可靠性。结果表明:获得的核酸序列长564 bp,编码188个氨基酸;推导的氨基酸序列与西伯利亚蓼、拟南芥、小麦GAPDH基因编码的氨基酸序列同源性分别为92%、90%和89%;扩增曲线和熔解曲线显示设计的引物可应用于实时荧光定量PCR扩增。羊蹄GAPDH基因的克隆为利用实时荧光定量PCR技术研究目的基因表达情况奠定了基础。     

辣椒疫霉效应因子RxLR115890不同侵染时期的差异性表达

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)能够产生370多个RxLR效应分子,绝大多数效应分子的特性都是未知的。为了对辣椒疫霉RxLR效应因子开展深入的功能研究,本研究以辣椒疫霉SD33菌株的DNA为模板,设计辣椒疫霉菌以及RxLR115890的特异性引物。采用实时荧光定量PCR检测RxLR115890在辣椒疫霉游动孢子侵染条件下,不同时间的表达量。结果显示,RxLR115890的表达量在侵染前期有明显的上调表达,伴随着侵染时间的加长表达量迅速下降,又在12 h处再次轻微上调。由此得出结论,RxLR115890对辣椒疫霉菌的前期侵染具有至关重要的作用。为RxLR115890后续的研奠定了基础。     

不同来源辣椒疫霉菌的遗传多样性分析

[目的]探索来自辣椒寄主和土壤的辣椒疫霉的遗传多样性。[方法]通过利用12个10碱基随机引物对来自我国4个不同地理区域的22个辣椒疫霉菌株的亲缘关系进行RAPD分析。[结果]受试22个菌株共产生101条谱带,其中多态性为99条,占98.02%,说明受试辣椒疫霉菌具有丰富的遗传多样性。根据引物扩增的DNA指纹图谱,运用UPGMA分析法,以遗传相似系数0.5为阈值,将供试22个菌株划分为3个遗传聚类组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。RAPD标记技术分析表明,来辣椒寄主和土壤的菌株的全基因组DNA扩增图谱差异很大。[结论]供试菌株具有丰富的遗传多样性,来自不同遗传背景的菌株差异显著,聚类组的划分与菌株的来源有一定的相关性。     

白木香愈伤组织与叶片DNA快速提取方法的确定

[目的]确定白木香愈伤组织与叶片DNA的快速提取方法.[方法]用TE、ES1、ES2 3种提取液及相应的方法提取叶片和愈伤组织总DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测提取产物,通过普通PCR及荧光定量PCR检查DNA的可用性,并将PCR产物经克隆测序验证.[结果] ES1法提取的叶片和愈伤DNA条带清晰,纯度较高;普通PCR和荧光定量PCR可扩增出200和600bp左右的目的条带.ES2法提取液电泳不能检测到DNA条带,但PCR可扩增出愈伤组织200bp左右目的条带.TE法得到的提取液检测不到DNA条带且PCR不能得到目的条带.[结论] ES1提取液及相应的提取方法可用于白木香愈伤和叶片DNA高通量快速提取,为沉香属植物种质研究和分子研究奠定基础.     

几种提取乌苏里貉毛囊核酸方法的比较(英文)

[目的]该研究旨在探讨提取乌苏里貉毛囊核酸的可靠方法。[方法]本实验分别利用改进的有机酚法,chelex-100法,PCR缓冲液法和试剂盒法,从乌苏里貉毛发中提取核酸DNA,对所提核酸进行PCR扩增及电泳分析,并且对四种方法进行比较。[结果]经分光光度计测定和凝胶电泳检测,本实验研究结果表明chelex-100提取的核酸有蛋白质等杂质,PCR缓冲液法提取核酸浓度低有机酚法和试剂盒法提取的DNA浓度高,且没有杂带。[结论]本研究为进一步探索高效,简便的提取乌苏里貉毛囊核酸DNA提供了有力的科学理论基础。     

鱼腥草叶片总RNA提取方法研究

[目的]筛选出适合鱼腥草（Houttuynia cordata）叶片RNA提取的方法。[方法]以鱼腥草叶片为材料,比较了经典RNA提取试剂盒、Trizol试剂盒A、Trizol试剂盒B以及富含多糖类材料RNA提取试剂盒提取鱼腥草RNA的效果。[结果]Trizol试剂盒A、Trizol试剂盒B和经典RNA提取试剂盒难以提取出高质量的RNA,而富含多糖类材料RNA提取试剂盒提出的RNA质量高,完整性好,可以满足进一步分子生物学研究的要求。[结论]普通RNA提取试剂盒难以提取出鱼腥草叶片的RNA。     

一种用于转基因水稻快速检测的DNA提取方法

[目的]建立一种快速筛选转基因水稻的DNA提取方法。[方法]对试剂盒法和快速法2种DNA提取方法进行比较,并分别用转Ta NADP-ME1和Ta NADP-ME2基因的转基因水稻进行验证。[结果]用快速法提取得到的DNA进行PCR扩增,可分别得到约1 700 bp的Ta NADP-ME2基因和约1 900 bp的Ta NADP-ME1基因,且条带清晰明亮,与试剂盒法相比无显著差异。[结论]该研究中快速提取DNA的方法经济、简便、快捷,适合用于对大量转基因样品进行检测。     

一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法

[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。[结果]2种方法提取的土壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg^2＋用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷。同时适用于PCR分析。为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。     

TRIS饱和酚一步法提取食用菌DNA

[目的]为探索食用菌子实体DNA的快速提取方法。[方法]以4种广泛栽培的食用菌子实体为材料,采用改进的TRIS饱和酚法提取食用菌基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳和PCR技术检测提取DNA样品的质量。[结果]获得的食用菌DNA质量较好,能够满足PCR等后续分子生物学试验。[结论]TRIS饱和酚法是一种简单、快速提取食用菌DNA的方法。     

几种橡胶基因组DNA提取方法的比较

[目的]比较4种提取橡胶叶基因组DNA方法,为后续研究根据需要采用不同的DNA提取方法提供依据。[方法]分别采用TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒提取法、E.Z.N.A.TMHigh Performance（HP）Plant DNA Kit提取法、CTAB法、改良的CTAB法提取橡胶基因组DNA,通过紫外分光光度计测定不同方法所提取DNA的纯度和浓度,并通过电泳和酶切检测。[结果]采用改良的CTAB法提取的橡胶基因组DNA纯度最高,质量最好;采用其他方法所得的基因组DNA均有不同程度的多糖多酚以及蛋白的污染。[结论]采用改良的CTAB法所提取的橡胶基因组DNA因其完整性好、浓度高、纯度高可用于对DNA质量要求高的试验中。若是后续研究对DNA质量要求不高,则可以选择试剂盒,省时省力。     

疫霉侵染的辣椒cDNA文库的构建及非特异性脂转移蛋白cDNA的筛选

建立了辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,该原始文库含有1.5×106个独立克隆,插入片段约为0.5-2 kb.采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从该cDNA文库中筛选出了1个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA.经生物信息学分析,推测这个候选基因为非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid-transfer protein,nsLTP)基因.