一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法

[目的]对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。[方法]采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。[结果]2种方法提取的土壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg^2＋用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。[结论]CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷。同时适用于PCR分析。为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。     

一种适宜于文库构建的土壤微生物总DNA提取方法

采用改良的方法提取2种土壤微生物总DNA,并采用透析法对提取的DNA进行纯化,与MO BIO公司PowerSoil DNA isolation Kit试剂盒法进行比较,结果表明,改良的土壤微生物总DNA提取方法提取到的DNA明显高于试剂盒提取的DNA,且A260/A280及A260/A230与试剂盒提取的相差不大,片段也较大,是一种经济方便的土壤微生物总DNA提取方法,比较适合用于构建高质量的宏基因组文库.     

应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测农田土壤微生物短期动态变化

在一块农田里于一个月内连续采集5次土样,提取土样微生物总DNA,应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测土壤微生物的动态变化.结果表明,细菌16SrDNA和真菌18S rDNA的PCR-RFLP图谱在5个采样时间点上基本一致;细菌的PCR-TGGE图谱平均有40条带,其相似性在90%以上,真菌的平均有20条带,其相似性在70%以上.说明这块农田土壤细菌区系短期内变化不大,而真菌区系存在较小幅度的动态变化,并且细菌多样性远远高于真菌多样性.比较两种分子生物学方法的结果表明,PCR-TGGE技术比PCR-RFLP技术更能精确地反映土壤微生物的动态变化,并且能同时快速地对多个样品进行有效区分.     

采用实时荧光定量PCR技术比较提取土壤真菌DNA方法的差异

[目的]采用实时荧光定量PCR技术比较手提方式和OMEGA微量土壤DNA提取试剂盒获得土壤中真菌DNA的差异。[方法]接种5个梯度稀释的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）菌丝到灭菌土壤中,并设置不接种的样品为阴性对照。采用手提方式和OMEGA土壤微量DNA提取试剂盒分别提取制备的土壤样品,采用实时荧光定量PCR方法和辣椒疫霉菌的特异性引物对土壤样品中的辣椒疫霉菌进行定量,并对结果进行比较,分析两种方法的特点。[结果]手提方式和试剂盒方式获得的土壤真菌DNA受土壤中杂质的影响较小,并且均能获得适合实时荧光定量PCR技术的模板DNA。采用试剂盒方式获得的辣椒疫霉菌定量结果比手工提取方式获得的辣椒疫霉菌定量结果平均高2.78倍。[结论]采用OMEGA微量土壤DNA提取试剂盒方法获得的菌体基因组DNA的量较多,定量结果更精确;手提方法所需试剂均为常用生化试剂,方便获得且价格低廉。因此,两种方法各有优势,可以根据实际情况选择。     

应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测农田土壤微生物短期动态变化

在一块农田里于一个月内连续采集5次土样，提取土样微生物总DNA，应用PCR-RFLP及PCR-TGGE技术监测土壤微生物的动态变化。结果表明，细菌16S rDNA和真菌18S rDNA的PCR-RFLP图谱在5个采样时间点上基本一致；细菌的PCR-TGGE图谱平均有40条带，其相似性在90％以上，真菌的平均有20条带，其相似性在70％以上。说明这块农田土壤细菌区系短期内变化不大，而真菌区系存在较小幅度的动态变化，并且细菌多样性远远高于真菌多样性。比较两种分子生物学方法的结果表明，PCR-TGGE技术比PCR-RFLP技术更能精确地反映土壤微生物的动态变化，并且能同时快速地对多个样品进行有效区分。     

适用于竹林土壤PCR-DGGE分析用的微生物总DNA提取及纯化方法

为了获得完整、高纯度的竹林土壤微生物总DNA,采用改良的十二烷基硫酸钠-高盐抽提法对5种竹林土壤进行DNA提取,通过DNA凝胶回收试剂盒纯化粗提的DNA,利用细菌16 SrDNA基因的V3区引物对纯化的DNA进行了聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）验证。结果表明,该方法所需土壤样品少,抽提的DNA片段均在23kb以上,完整性好;采用DNA凝胶回收试剂盒纯化能够有效去除粗提DNA中大部分杂质,获得高质量的DNA;以此DNA为模板进行DGGE检测所反映的微生物信息量丰富。图3表1参15     

森林土壤微生物总DNA的提取方法

通过对土壤微生物总DNA的提取方法改进,获得改进提取法。利用改进提取法与MO BIO公司PowerSoil DNA Isolation Kit的试剂盒法,对4种不同林分的土壤微生物总DNA进行提取验证。结果表明,2种方法均能有效提取森林土壤总DNA,试剂盒法操作简单,DNA的提取质量高,后续PCR效果好,但其提取的DNA量较少且成本昂贵;改进提取法提取的DNA量是试剂盒法的2倍,较经济,但耗时较长,操作繁琐,后续PCR效果与试剂盒法比较相差不大,由于其DNA提取量多,该提取方法较适合应用于土壤宏基因组相关的分子生态学研究中。     

不同环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化

采用SDS高盐缓冲液抽提法提取了林地、厂区、菜地3种不同环境中土壤微生物总DNA,结果表明,该方法可以从土壤微生物中提取到长度大于23.1kb的DNA;不同环境中提取的DNA产量和纯度都存在一定的差异,每克干土的DNA提取量介于53.55~579.93μg之间,其中以处于原始状态的丛林提取量最高。粗提的土壤微生物DNA采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂进行纯化,纯化后的土壤微生物DNA可以用于PCR扩增,使用细菌16SrDNA基因的引物可以扩增到相应的片段。     

4种不同土壤微生物DNA提取方法对DGGE分析微生物群落的影响

分别应用高盐法、玻璃珠破碎法、冻融法和试剂盒法4种不同土壤微生物DNA提取方法提取水稻稻田土壤微生物DNA,并通过细菌16SrRNA V3区通用引物GC338f-530R和真菌18SrRNA特异性引物NS1-GCFung进行PCR扩增结合变性梯度凝胶电泳(CGGE)分析,对4种DNA提取方法进行评价。结果表明,玻璃珠破碎法和试剂盒法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求;其中试剂盒方法操作简单,提取的DNA质量较高,但DNA产量较低且成本昂贵;玻璃珠破碎法用时较长,步骤繁琐,DNA产量较高,纯度较低,但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响,且成本低廉。     

适用变性梯度凝胶电泳分析的石油污染土壤微生物DNA模板制备的研究

[目的]为了快速、简便和经济地获得理化性质不同的石油污染土壤中微生物总DNA,以用于后续微生物群落结构分析及动态监测。[方法]采用3种提取方法对石油污染土壤中细菌总DNA进行提取,并通过DNA产量、纯度、片段大小、基因组完整性等对提取得到的DNA质量进行评价;并对16S rDNAV3可变区的PCR扩增产物进行DGGE分析。[结果]采用3种方法均能从石油污染土壤中提取得到相应的细菌DNA片段,且针对同一种提取方法,土壤理化性质的差异对DNA提取效果影响不明显,但不同方法提取得到的DNA在浓度和纯度上存在明显差异。采用3种方法提取得到的DNA量分别可达98.3、79.9和43.8 ng/μl。[结论]选取方法1提取基因组DNA并进一步纯化,纯化后的DNA分别采用引物F27/R1492和F357/R518进行16S rDNA及116S rDNAV3可变区的扩增,获得了条带清晰、浓度高、无污染的DNA目的片段;对其PCR扩增产物进行DGGE分析,得到的DGGE图谱可直观反应石油污染土壤中微生物的多样性及优势种群。     

麦田土壤细菌群落16S rDNA V3片段PCR产物的DGGE分析

以郑州市郊冬小麦农田土壤为研究对象,利用改进的土壤DNA提取方法提取土壤微生物基因组,并采用降落式PCR和DGGE电泳技术对细菌16S rDNA V3区进行扩增和产物分离,分析了小麦4个生育时期3个土层深度的细菌群落变化.结果表明,麦田土壤细菌多样性极高,小麦整个生育期土壤中一直存在数种优势菌群.但各时期都有新的不同的细菌出现,整体表现为随着小麦的生长多样性逐渐增加,收获期减少.表层土壤各生育时期菌群数量变化较大,而深层土壤菌群数量变化较小.     

不同种植模式对青稞根际土壤微生物群落结构的影响

采用Illumina MiSeq高通量测序技术,对6种种植模式下青稞根际土壤的16S rDNA和18S rDNA基因相关区片段进行测序,研究根际土壤细、真菌群落结构的变化,并结合土壤理化性质,分析环境因子与群落结构的关系,从根际土壤微生物生态系统的角度解析青稞连作障碍的发生机制。6种种植模式中,土壤有机质和全氮含量WHD模式最高,全磷含量YC模式最高,全钾含量MLS模式最高,pH均为碱性;3种连作模式下,随着连作年限的增长,土壤有机质、全氮和全钾逐年降低,全磷显著升高。6种种植模式下,细菌和真菌群落Alpha多样性指数和覆盖度没有显著差异,与连作相比,WHD和MLS模式可显著提高细菌群落的Shannon指数、ACE指数和Chao1指数;与混作、轮作相比,连作显著提高真菌群落的Shannon指数和ACE指数,但Chao1指数差异不显著;连作使细菌群落Alpha多样性减小,真菌群落Alpha多样性增加。6种种植模式下,genus水平群落结构表现为连作使青稞根际土壤中微生物区系发生较大改变,导致有害菌群丰度增加,有益菌群数量减少,尤其是真菌菌群发生较大改变,而轮、混作模式使优势菌群及新种数量明显增加。细菌、真菌群落PCoA分析结果表明,微生物群落在6种种植模式间变异较小且未发生明显分化,PC1、PC2的总解释能力均大于80%,表明有显著主导因子。细菌、真菌群落与土壤理化性质关系显示,土壤有机质、全氮与提高WDH、QKA模式下的细菌群落多样性呈正相关,而pH、有机质、全氮与提高WDH、YC、QKB模式下的真菌群落多样性呈正相关。表明,与连作相比,WDH和MLS模式可改善土壤理化性质,提高根际细菌群落结构多样性及微生物群落组成,是缓解青稞连作障碍的可能途径,可为青稞连作障碍修复措施的制定提供科学依据。     

农田利用方式对剑湖湿地土壤微生物多样性的影响

【目的】对剑湖湿地土壤微生物多样性进行研究,了解农田利用对剑湖湿地土壤微生物多样性的影响,为湿地土壤的合理利用及云南高原退化湿地的研究与保护提供科学依据。【方法】选择蔬菜地、小麦地、蚕豆地、油菜地和湖滨带5种不同农田耕种方式湖滨带土壤为采样点,采用正方形五点取样法采集土壤样品。试剂盒提取5个采样点的土壤总DNA,应用PCR-DGGE技术对5种土壤的细菌群落结构多样性指数(H')、丰度(S)和均匀度(J)进行研究,运用理化性质测定方法测定土壤有机质、总氮、总磷等理化指标。【结果】不同利用方式湖滨带土壤细菌多样性指数、丰度和均匀度均有所不同,天然湖滨带土壤的细菌多样性指数、均匀度、丰富度均高于农田耕种土壤;天然湖滨带土壤细菌群落结构与农田利用土壤相似性较低,单独聚为一类,农田耕种土壤细菌群落结构相似性较高,在82%的相似水平上聚为一类;在93%相似水平上5个土壤样品聚为5个类群;不同土壤样点间具有许多共同的条带,不同农田利用土壤细菌的优势种群均属于变形菌门(Proteobacteria)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、紫色杆菌属(Janthinobacterium)、杜擀氏菌属(Duganella)、埃希氏菌属(Escherichia)和链球菌属(Streptococcus)6大类。【结论】剑湖湿地湖滨带土壤微生物群落结构多样性较丰富。不同农田利用方式下剑湖湿地湖滨带土壤的理化性质有一定差异,影响了土壤微生物群落结构的变化,从而影响土壤微生物多样性的变化。     

烟草根黑腐病不同发病程度与土壤养分及微生物群落的关系

【目的】分析烟草根黑腐病发病程度对土壤养分及微生物群落结构的影响,探究不同病害发生条件下土壤环境、微生物群落间的关系,为烟草根黑腐病防控提供理论依据。【方法】以贵州省安顺烟区为调查区域,收集烟草根黑腐病不同发病程度(0、1、3、5级)烟株根际土壤,测定土壤理化性质;采用16S rDNA和ITS基因测序技术进行分析,探讨不同发病程度下烟株根际土壤养分、细菌及真菌群落结构差异。【结果】与正常土壤相比,随着病害程度的加重,土壤细菌群落的均匀度和丰富度降低,而真菌群落的均匀度和丰富度升高。与正常土壤相比,发病土壤中细菌群落鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Candidatus_Udaeobacter、苔藓杆菌属(Bryobacter)和芽单胞菌属(Gemmatimonas)相对丰度下降,而芽孢杆菌(Bacillus)丰度上升;同时真菌群落镰刀菌属(Fusarium)、柱孢属(Cylindrocarpon)、毛霉属(Mucor)丰度下降,而Nicotiana、茎点霉属(Setophorna)、亡革菌属(Thanatephorus)、锥毛壳属(Coniochaeta)、织球壳菌属(Plectosphaerella)和四枝孢属(Tetracladium)丰度上升。指示物种分析结果表明,芽单胞菌属、织球壳菌属和四枝孢属可能是不同发病程度土壤细菌、真菌群落属水平差异的主要物种。冗余分析(RDA)和方差分解分析(VPA)结果表明,土壤铵态氮(NH-N)和有机质(SOM)是细菌、真菌群落结构发生变化的主要驱动因子。【结论】根际土壤中细菌芽单胞菌属丰度的下降和真菌四枝孢属丰度的上升是烟草根黑腐病严重发生的关键微生物因素,提高土壤SOM和NH-N含量能有效降低烟草根黑腐病发病程度。     

过量施肥下氮素形态对旱地土壤细菌多样性的影响

采用细菌16SrDNA的PCR-RFLP技术,以西北地区土垫旱耕人为土为材料,模拟田间过量施肥水平,经室内恒温短期培养,研究了过量施肥下酰胺态氮、硝态氮和铵态氮对土壤细菌多样性的影响。结果显示:PCR-RFLP分析酰胺态氮(T1)、硝态氮(T2)和铵态氮(T3)过量施肥处理的细菌16SrDNA克隆文库,分别得到17、25和130个酶切分型,不施肥对照(CK1)和正常施肥对照(CK2)分别得到119和187个酶切分型,表明正常施肥处理的酶切分型最多,过量使用酰胺态氮和硝态氮减少了酶切类型,而过量施用铵态氮可以维持与不施肥对照相近的酶切类型数量。采用α多样性测度对试验结果进行分析统计表明,不同处理间土壤细菌的多样性指数(H'、Ds)和物种丰富度指数(dM)a均为CK2>T3>CK1>T2>T1处理,表明合理施肥可显著增加土壤中细菌的多样性,而过量施用酰胺态氮则减少细菌的多样性,使用铵态氮处理可维持细菌多样性;除正常施肥对照(CK2)外,其余各处理都出现了优势菌种。通过对优势菌的16SrDNA序列比对发现,酰胺态氮处理都为未培养细菌,硝态氮处理和铵态氮处理的优势菌呈现了菌属多样性,前者包括变形菌门的假单胞菌属和寡养...     

不同处理方式对奶牛粪细菌群落多样性及群落结构的影响

以腐熟牛粪、新鲜牛粪以及蚯蚓粪为材料,提取其微生物总DNA,利用细菌16S rDNA V3区扩增及变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)法,分析了3种材料中细菌的多样性以及细菌群落结构的相似性.结果表明,蚯蚓粪的细菌多样性最丰富,腐熟牛粪次之,新鲜牛粪的细菌多样性最小.蚯蚓粪和腐熟牛粪的细菌群落结构有40%的相似性;蚯蚓粪和新鲜牛粪的细菌群落结构的相似性为25%;新鲜牛粪和腐熟牛粪的细菌群落结构的相似性则为35%.