辣椒疫霉作用下叶绿素a/b结合蛋白的表达

从基于cDNA-AFLP分析的辣椒应答疫霉侵染的表达谱中找到1个特异表达基因的序列;利用这个序列设计引物,采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从疫霉处理的辣椒cDNA文库中筛选出这个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA;经生物信息学分析,推测这个长度为1022 bp的候选基因为辣椒叶绿素a/b结合蛋白(chlorophyll a/b binding protein,cab)基因;并利用荧光定量PCR法检测cab在疫霉侵染下的表达情况。     

辣椒疫霉菌诱导辣椒酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一,对我国辣椒生产造成严重的经济损失。为深入研究辣椒疫霉的致病机制,寻找辣椒疫霉在辣椒体内的互作蛋白,利用SMART同源重组交换技术,在酵母菌株Y187中构建了被辣椒疫霉侵染不同时期辣椒的cDNA文库。文库质量评定结果显示cDNA文库的滴度为1.13×10~6 CFU/m L,文库的库容量为1.7×10~7 CFU,文库的重组率为96%,插入片段平均长度在1Kbp左右。该文库的构建为研究辣椒疫霉的致病机制、辣椒的抗病机制及寻找药物靶标位点奠定基础。     

紫外线照射辣椒叶片cDNA文库构建及部分防御信号基因cDNA的检测

对抗病的朝天椒地方品种,以紫外线(UV)处理叶片并提取叶片总RNA,采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了一个cDNA文库.该文库含有2.6×106个独立的噬菌斑克隆,扩增后滴度达到1.5×109pfu.μL-1,随机挑取的噬菌斑PCR检测发现重组率达90.0%.在搜索、拼接与植物WRKY、bZIP、AP2和E2等重要调节基因同源的辣椒表达序列标签(ESTs),获得重叠群的基础上,分别设计上述基因ESTs重叠群特异性引物,以cDNA文库为模板进行PCR扩增.结果表明,部分上述基因cDNA存在于文库中.因此,本研究所构建的文库可用于进一步分离响应UV的重要调节基因cDNA的分离.     

致病疫霉酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

致病疫霉是引起马铃薯晚疫病的重要病原菌,在全世界范围内造成了严重的经济损失。以2种不同致病力的致病疫霉菌株侵染马铃薯叶片5个时间点的混合菌丝样品作为cDNA文库的材料来源,利用Gateway法分别构建了初级文库与次级文库,初级文库与次级文库的库容量分别为1.60×10⁷、1.52×10⁷ CFU,插入片段长度大多在1 000～2 000 bp之间,重组率均达到100%。次级文库质粒转化酵母菌构建酵母文库,所得酵母文库滴度为1.00×10⁸ CFU/mL,转化效率为6×10⁸ CFU/μg。结果表明,本研究构建的酵母双杂交cDNA文库质量较高,完全可以满足互作蛋白高质量、高效率筛选的要求。该文库为后续深入解析致病疫霉的致病机制奠定了基础。     

辣椒CaMAPK7的全长cDNA克隆及其表达分析

以辣椒均一化cDNA文库为模板,通过特异性引物的PCR扩增,获得CaMAPK7全长cDNA序列,该序列含有1个370个氨基酸序列的开放阅读框,与拟南芥等其他植物具有84%-97%的氨基酸同源性。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在辣椒的根、茎和叶中均有不同程度的组成型表达,在根部的表达最高,在叶片中该基因的表达受到青枯菌侵染、高温等逆境及水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯等外源激素处理的诱导,但脱落酸处理使其表达下调。这些结果表明CaMAPK7可能在辣椒应答青枯病和高温等逆境胁迫中起着重要的作用。     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究

 【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Western blot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43 kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Western blot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。     

辣椒泛素交联酶cDNA的分离及其在UV-B作用下的表达分析

利用96孔板法从UV处理的辣椒叶片cDNA文库中分离获得了一个cDNA阳性克隆,其长度为678 bp,含有148个氨基酸的开放读码框,与马铃薯等其他植物的泛素交联酶基因有较高的同源性,命名为CaE21.荧光定量PCR分析表明CaE21基因在UV-B作用下转录表达水平降低;当UV-B照射停止后,其表达水平逐渐回升.推测该基因与辣椒适应UV-B照射胁迫有关.     

辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表达

辣椒疫霉是一种侵染性植物病原,能引起多种茄科及葫芦科植物的病害。利用同源克隆法从辣椒疫霉基因组内克隆了漆酶基因Pclac3,该基因全长1 881个核苷酸,编码626个氨基酸,与已知的真菌漆酶基因具有较高的同源性,并且具备漆酶基因的保守区域。利用PCR将该基因克隆于pPIC9K载体,并转化于毕赤酵母GS115,经过1%甲醇诱导表达获得其异源表达产物。将表达产物进行SDS-PAGE检测,获得分子量大约为90 kDa的特异蛋白。利用ABTS法对Pclac3的表达产物粗酶液进行酶活性分析发现,其活性在第11天时最大,达到45 U/mL。这为研究辣椒疫霉漆酶基因家族及探索卵菌漆酶生物活性及其潜在的应用提供了理论依据。     

干旱胁迫下甘蔗幼苗cDNA文库构建与乙烯反应转录因子cDNA筛选研究

以甘蔗幼苗叶片为材料,建立了干旱胁迫下的甘蔗幼苗cDNA文库。文库质量鉴定结果表明,文库的滴度为1.4×106PFU/mL,重组率约为96.2%,扩增后的滴度为1.6×109PFU/mL,容量约为2.8×109PFU,插入片段大小在0.5-2.0 kb之间。利用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从文库中筛选到1个响应干旱胁迫的目标基因的全长cDNA,经生物信息学分析,推测候选基因为乙烯反应转录因子(ethylene response factor,ERF)基因。     

晚疫病诱导的番茄叶片cDNA文库构建及序列分析

以番茄抗病品系(CLN2037E)为研究材料,应用SMART技术构建晚疫病诱导的番茄叶片cDNA表达文库,并进行生物信息学分析。成功构建的cDNA文库的克隆数为2.3×109,重组率为96%,通过PCR检测,插入片段范围在0.1~2.0 kb之间。从文库中随机挑取110个克隆进行测序,最终得到107条差异表达ESTs序列。GenBank提交的序列号为GT742146-GT742150;GT865998-GT866099。利用BLAST进行同源性分析:75条ESTs与其他物种同源性较高,视为已知基因,功能涉及能量代谢的占42.7%、细胞内生命活动与信号传导的占10.7%、基因转录和翻译的占9.3%以及与抗性相关的占25.3%;另有32条ESTs无同源序列或同源性较低,预测是一些未知功能基因的占30%。本项研究应用SMART技术成功构建了高质量、信息丰富的晚疫病诱导的番茄叶片cDNA文库,为进一步筛选抗病相关候选基因奠定了基础。     

赤子爱胜蚓全长cDNA文库的构建及初步鉴定

以赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)为材料,λTriplex2TM为载体,利用SMART技术构建全长cDNA文库,从而筛选全长目的基因并研究其结构和功能。经测定原始文库滴度为1.3×106pfu/mL,扩增总文库滴度为1.0×108pfu/mL,重组率达到99%以上,插入片段长度在1.1 kb左右。该文库的建立为功能性新基因的发现奠定了坚实的基础。     

草莓果实cDNA文库的构建及鉴定

草莓是研究果实发育的模式植物。基因表达谱分析已成为目前分子生物学领域重要的研究方向。草莓cDNA文库构建是研究果实发育基因表达的基础工作。本研究从草莓白果中提取高质量的总RNA,通过MMLV反转录酶的作用,把RNA中的mRNA反转成cDNA第一链,再利用特异引物通过LD-PCR扩增合成双链cDNA。将纯化带有黏性末端的双链cDNA与λTrip I Ex2载体进行连接,最后对重组载体进行E.coli XL1-Blue体外包埋为cDNA原始文库。经过鉴定,原始文库的滴度为1.13×10-7 cfu/mL,重组率为100%,插入片段多分布在0.2~2.0kb之间,表明构建的草莓果实cDNA文库质量较高,能够满足后续的分子生物学研究工作的需要,同时也为其他果树相关研究提供借鉴。     

新疆雪莲全长cDNA文库构建及表达序列标签(ESTs)特性分析

以野生新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kit)为研究材料,利用Creator SMARTTM cDNA Library Construction技术构建了雪莲全长cDNA文库,从野生雪莲中提取总RNA和mRNA , 用分离到的微量mRNA合成cDNA第1链.通过长距离PCR扩增得到足够量的双链cDNA .将SfiⅠ酶切后并纯化的cDNA片段连接到经SfiⅠ酶切的噬菌体λTripIEX2上, 并对噬菌体进行包装,建成cDNA的全长库.经大肠杆菌XL1-Blue平板检测,原始文库滴度达4.03×107(pfu/mL).随机挑选500个克隆进行序列测定,PCR鉴定结果显示多数插入片段均在500 bp以上.将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较,共有56个序列为非冗余数据.其中有14个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性,42个片段与已报道的基因有较高的同源性.这些EST数据为进一步筛选和克隆雪莲特异性表达基因提供了材料平台,为雪莲基因组数据增补了大量信息.     

水稻抽穗期基因酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

为研究水稻开花调控的分子网络,构建了水稻品种中花11幼穗分化前倒二叶叶片的酵母双杂交cDNA文库。制备了高质量的总RNA,用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和Long Distance PCR合成双链cD-NA,通过SMART同源重组交换技术在酵母菌株AH109中建立酵母双杂交所需的水稻倒二叶叶片cDNA文库。文库质量检测结果表明:cDNA文库的转化率为1.178×106/3μg pGADT7-Rec,文库滴度为2.65×108 cfu/mL,重组率为94.7%,插入片段长度为350～2 000bp。该文库可用来筛选水稻抽穗期基因的互作蛋白。     

中华绒螯蟹血细胞cDNA文库的构建及质量初检

为了筛选中华绒螯蟹Eriocheir sinensis血细胞免疫的相关基因,促进蟹类免疫防治的进展,采用Gubler-Hoffman法构建了中华绒螯蟹血细胞的cDNA文库。结果表明：该文库初始滴度为4.50×106cfu/mL,库容为3.3×106cfu/mL,重组率为73%,插入片段大小多为800~2 500 bp。随机挑取了94个重组子进行测序初检,共得到93条平均长度为511 bp的表达序列标签（EST）序列,对所测EST序列进行拼接,得到75条一致性序列,包括15条重叠群（Contigs）和60条单一序列（Singleton）。对测序结果进行比对分析,获得了15条已报道有一定功能的一致性序列,其中4条与免疫相关;另外60条一致性序列还未见报道。研究表明,中华绒螯蟹血细胞cDNA文库已构建成功,且质量较高,从而为开展中华绒螯蟹功能基因克隆、分析和功能基因组学研究奠定了基础。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

二斑叶螨cDNA文库的构建及鉴定

为研究二斑叶螨发育相关基因的功能,利用TRIzol试剂提取二斑叶螨总RNA,通过SMART技术构建cDNA文库.利用SMART IVTM Oligonucleotide和CDSIII/3忆PCR Primer为引物,在反转录酶作用下,合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经酶切回收后,再连接pDNR-LIB载体,转化大肠杆菌感受态细胞Trans5琢,检验库容量和重组效率,并采用PCR方法检测插入cDNA片段的大小.结果表明,构建的二斑叶螨cDNA文库的库容量为3.54C6 CFU/mL,重组效率达95.8%,插入片段长度在0.3~2.0 kb之间。构建的二斑叶螨cDNA文库质量良好袁能够为进一步研究二斑叶螨基因的功能奠定基础。