疫霉侵染的辣椒cDNA文库的构建及非特异性脂转移蛋白cDNA的筛选

建立了辣椒疫霉侵染的辣椒幼苗cDNA文库,该原始文库含有1.5×106个独立克隆,插入片段约为0.5-2 kb.采用基于PCR技术的96孔文库筛选方法,从该cDNA文库中筛选出了1个应答辣椒疫霉侵染的候选基因的全长cDNA.经生物信息学分析,推测这个候选基因为非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid-transfer protein,nsLTP)基因.     

辣椒CaMAPK7的全长cDNA克隆及其表达分析

以辣椒均一化cDNA文库为模板,通过特异性引物的PCR扩增,获得CaMAPK7全长cDNA序列,该序列含有1个370个氨基酸序列的开放阅读框,与拟南芥等其他植物具有84%-97%的氨基酸同源性。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在辣椒的根、茎和叶中均有不同程度的组成型表达,在根部的表达最高,在叶片中该基因的表达受到青枯菌侵染、高温等逆境及水杨酸、茉莉酸甲酯和乙烯等外源激素处理的诱导,但脱落酸处理使其表达下调。这些结果表明CaMAPK7可能在辣椒应答青枯病和高温等逆境胁迫中起着重要的作用。     

辣椒疫霉（Phytophthora capsici）果胶甲基酯酶Pcpme3基因真核表达及功能研究

 【目的】对辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcpme3基因进行真核表达,制备其特异性抗血清,为用Western blot检测该基因在辣椒疫霉致病过程中的功能奠定基础。【方法】利用TR-PCR分离鉴定Pcpme3的成熟肽片段,克隆于pPIC9K载体。将获得的表达载体转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析和免疫家兔制备特异性抗体。【结果】酵母转化子经MD、MM平板筛选和G418抗生素筛选与PCR鉴定,获得Mut+/His+表型高拷贝重组转化子,经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE检测发酵上清液,检测出43 kD的特异蛋白。重组蛋白免疫家兔制备特异抗血清,Western blot检测该基因在游动孢子侵染辣椒叶片中的表达,随着病情加重,该基因的表达逐渐增强,从而证明该基因参与了病菌的侵染致病过程。【结论】利用真核表达获得的蛋白制成特异性抗体可以有效地检测Pcpme3在辣椒疫霉侵染寄主过程中的功能特性。     

辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表达

辣椒疫霉是一种侵染性植物病原,能引起多种茄科及葫芦科植物的病害。利用同源克隆法从辣椒疫霉基因组内克隆了漆酶基因Pclac3,该基因全长1 881个核苷酸,编码626个氨基酸,与已知的真菌漆酶基因具有较高的同源性,并且具备漆酶基因的保守区域。利用PCR将该基因克隆于pPIC9K载体,并转化于毕赤酵母GS115,经过1%甲醇诱导表达获得其异源表达产物。将表达产物进行SDS-PAGE检测,获得分子量大约为90 kDa的特异蛋白。利用ABTS法对Pclac3的表达产物粗酶液进行酶活性分析发现,其活性在第11天时最大,达到45 U/mL。这为研究辣椒疫霉漆酶基因家族及探索卵菌漆酶生物活性及其潜在的应用提供了理论依据。     

辣椒疫霉菌诱导辣椒酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一,对我国辣椒生产造成严重的经济损失。为深入研究辣椒疫霉的致病机制,寻找辣椒疫霉在辣椒体内的互作蛋白,利用SMART同源重组交换技术,在酵母菌株Y187中构建了被辣椒疫霉侵染不同时期辣椒的cDNA文库。文库质量评定结果显示cDNA文库的滴度为1.13×10~6 CFU/m L,文库的库容量为1.7×10~7 CFU,文库的重组率为96%,插入片段平均长度在1Kbp左右。该文库的构建为研究辣椒疫霉的致病机制、辣椒的抗病机制及寻找药物靶标位点奠定基础。     

辣椒疫霉elicitins基因的克隆及瞬时表达分析

通过挖掘辣椒疫霉中的外泌蛋白激发子elicitins的基因序列,分析其转录特征,克隆基因序列并进行瞬时表达,以阐明其在辣椒疫霉生长发育和侵染过程中的作用。本研究利用转录组测序结果和致病疫霉INF1序列作为比对序列,对辣椒疫霉基因组数据库进行elicitins序列挖掘。采用RT-PCR方法分析elicitins基因在辣椒疫霉生长发育(菌丝、游动孢子囊、游动孢子、萌发的休止孢)和侵染寄主阶段(本氏烟灌根1.5、3、6、12、24、36和72 h后)的转录水平。克隆elicitins基因序列,并与其他卵菌的elicitins进行序列比对,分析进化关系。在本氏烟上进行elicitins的瞬时表达分析。结果表明:经生物信息学分析获得14个含有信号肽编码序列的elicitins基因全长序列。新发现6个elicitins基因在辣椒疫霉生长发育和侵染寄主阶段差异表达。对这6个和之前报道的5个elicitins基因进行全长克隆,能够克隆出的10个elicitins都属于酸性elicitins,聚类分析可将其分在第一和第三聚类组。异源表达发现2个elicitins能够激发本氏烟产生过敏反应。本研究结果不仅为阐明elicitins在辣椒疫霉生长发育和侵染寄主过程中的作用提供了重要数据,也为植物抗疫病的基因工程提供了科学依据。     

紫外线照射辣椒叶片cDNA文库构建及部分防御信号基因cDNA的检测

对抗病的朝天椒地方品种,以紫外线(UV)处理叶片并提取叶片总RNA,采用SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建了一个cDNA文库.该文库含有2.6×106个独立的噬菌斑克隆,扩增后滴度达到1.5×109pfu.μL-1,随机挑取的噬菌斑PCR检测发现重组率达90.0%.在搜索、拼接与植物WRKY、bZIP、AP2和E2等重要调节基因同源的辣椒表达序列标签(ESTs),获得重叠群的基础上,分别设计上述基因ESTs重叠群特异性引物,以cDNA文库为模板进行PCR扩增.结果表明,部分上述基因cDNA存在于文库中.因此,本研究所构建的文库可用于进一步分离响应UV的重要调节基因cDNA的分离.     

辣椒几丁质酶基因受疫霉菌及灰霉菌侵染时的表达变化

通过对已知全部辣椒表达序列标签(EST)数据分析发现,辣椒中至少含7个编码几丁质酶基因(分别为CaCHT-1、CaCHT-2、CaCHT-3、CaCHT-4、CaCHT-5、CaCHT-6和CaCHT-1.1)。采用半定量RT-PCR技术,分析辣椒幼苗在分别接种疫霉菌和灰霉菌后CaCHTs表达强度的变化。结果表明:在受到辣椒疫霉菌侵染时,除CaCHT-6外,CaCHT-1、CaCHT-2、CaCHT-3、CaCHT-4、CaCHT-5和CaCHT-1.1的表达水平均明显上升;而受到辣椒灰霉菌侵染时,CaCHT-1、CaCHT-4、CaCHT-5和CaCHT-1.1的表达水平均有不同程度的上升,CaCHT-3未检测到有表达,CaCHT-2和CaCHT-6的表达水平无可见的变化。结果提示,辣椒几丁质酶基因大部分成员均可受辣椒疫霉菌和灰霉菌的侵染诱导表达。     

辣椒疫霉菌葡聚糖酶抑制蛋白的原核表达、纯化及结晶

葡聚糖酶抑制蛋白(GIP)是辣椒疫霉菌在病理环境下诱导产生的一类蛋白,是病原菌抗性蛋白的一种。本研究根据辣椒疫霉菌全基因组序列,通过生物信息学分析、序列比对获得葡聚糖酶抑制蛋白全长基因序列。以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因组为模板扩增GIP基因cDNA,并对其进行相关生物信息学分析。基因经测序验证后与载体pET28a(+)连接,构建好的重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli Rosetta),用IPTG诱导表达重组蛋白6×His-GIP。重组蛋白在5 mol/L尿素变性环境下进行亲和层析纯化,对纯蛋白进行透析、复性、浓缩后进行分子排阻层析纯化,并对获得的纯蛋白进行蛋白结晶试验,为进一步阐明GIP作用机理奠定基础。     

南方根结线虫诱导辣椒基因CaRKNIF2的克隆与分析

 【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。     

辣椒水通道蛋白基因CaAQP的克隆与序列分析

 【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE 技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并以4℃低温胁迫处理不同时间的抗寒品种P70为材料,利用Real time-PCR分析所克隆基因在辣椒低温胁迫前后的表达模式,以25℃处理为对照。【结果】在4℃低温胁迫处理后的耐寒辣椒品种P70叶片中分离到与水通道蛋白基因相关的差异表达片段,并利用RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为CaAQP,登录号为GU116569。序列分析表明,该基因大小为1 032 bp,含5′非编码区为69 bp,3′非编码区为210 bp,CDS长753 bp,编码250个氨基酸, 蛋白分子量为25.7 kD。应用生物信息学软件对CaAQP分析表明,CaAQP含有6个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其它物种TIP类液泡膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。聚类分析表明,CaAQP与番茄液泡膜水通道蛋白遗传距离最近,与禾本科的玉米和大麦遗传距离相对较远。Real time-PCR分析结果证实,该基因在低温胁迫下呈现下调表达的趋势。【结论】利用cDNA-AFLP并结合RACE技术首次在耐寒辣椒品种中克隆了水通道蛋白基因CaAQP,该基因属于MIP蛋白家族的一员,具有其典型的功能域,表达模式分析表明,该基因在低温胁迫过程中具有重要的调控作用,该研究结果为进一步探讨辣椒逆境胁迫过程中基因表达调控机制提供了重要信息。     

辣椒推定WRKY基因cDNA的生物信息学分析

[研究目的]该研究在利用同源克隆法分离到一个推定的辣椒WRKY转录因子的基础上,采用多种生物信息学方法对该序列进行特征分析和功能预测,以获得该基因及其编码蛋白更多的功能提示.[主要方法]应用Blast、ORF Finder、Wolf Psort、DNAMAN等软件或数据库,进行序列的相似性比较,开放读码框预测、保守域和编码蛋白质的功能等分析.[研究结果]所得到的序列是WRKY基因家族中的一个全长cDNA序列,与其它植物具有较高的同源性,该基因编码的蛋白具有WRKY保守结构域和锌指结构特征,亚细胞定位预测结果显示该蛋白定位于细胞核,具有WRKY转录因子的三维结构特征.[结论]所获得序列为辣椒WRKY基因家族的新成员,具有WRKY转录因子家族的基本特征,进化上有高度保守性.可能在调控植物的生长发育以及干旱、高温、高盐等逆境应答过程中起重要调节作用.因此.这一辣椒WRKY新基因有进一步研究的价值.     

辣椒CaHsfA2上游转录因子的筛选及耐热功能分析

【背景】辣椒作为一种在世界范围内普遍栽培的蔬菜,具有喜温不耐热的特性。随着近些年极端高温天气出现日渐频繁,热胁迫已经成为影响辣椒生产的主要环境因素之一,明确辣椒的耐热机制进而培育耐热品种对辣椒生产具有重要的意义。【目的】热激转录因子HsfA2在植物耐热性中发挥重要作用,筛选辣椒CaHsfA2上游的转录因子,并分析后者在辣椒耐热性形成中的作用,为进一步阐明辣椒耐热分子机制提供理论依据。【方法】以CaHsfA2起始密码子上游的955 bp启动子序列为诱饵,利用酵母单杂交（Y1H）技术,筛选CaHsfA2的上游转录因子,并通过Y1H点对点杂交、双荧光素酶报告系统（Dual-Luciferase）与萤火素酶互补技术（LCA）进一步验证二者之间的互作关系。利用qRT-PCR技术分析热胁迫下CaHsfA2上游转录因子在辣椒耐热品系‘R9’中的动态表达模式;利用基因瞬时表达技术分析上游转录因子的亚细胞定位;利用病毒诱导的基因沉默技术（VIGS）分析CaHsfA2上游转录因子的耐热功能。【结果】筛选获得了CaHsfA2上游转录因子CaBES1,验证了二者的互作关系,通过分析双荧光素酶报告系统的结果及CaBES1沉默辣椒植株中CaHsfA2的表达量发现,转录因子CaBES1对CaHsfA2具有转录抑制作用。亚细胞定位结果表明,CaBES1在细胞膜和细胞核上均有表达,热胁迫处理后细胞核内的荧光信号增强,符合其发挥生物学功能时由细胞质向细胞核转移的特性;动态表达模式分析表明,热胁迫下,CaBES1表达水平呈现先降低后升高的变化趋势,这也说明CaBES1可以响应热信号,为下一步对其耐热功能研究提供了支撑。辣椒CaBES1被沉默后,通过对比分析沉默植株和对照植株的表型、相对电导率、叶绿素含量等指标发现,CaBES1的沉默表达提高了CaHsfA2表达量并增强了辣椒的耐热性。【结论】CaBES1通过负调控CaHsfA2表达而抑制辣椒的耐热性。     

黄灯笼椒辣椒素合成途径pal基因克隆及表达分析（英文）

该研究对黄灯笼椒pal基因进行了PCR扩增、测序及生物信息学分析,在此基础上构建原核表达载体（pET-32a-pal）进行原核表达,分析外施茉莉酸条件下基因表达模式和辣椒素积累情况。生物信息学分析表明黄灯笼椒pal基因编码的蛋白质由683个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为74.28 kD,等电点为6.97。将原核表达载体在大肠杆菌E.coli BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明,诱导后表达目的蛋白质相对标准分子质量约为74 kD,与DNAMAN软件预测的（74.2 kD）基本一致。蛋白质序列比对和进化树分析表明,黄灯笼椒Capal蛋白与朝天椒Capal蛋白一致性较高,进化距离最近。Real-time PCR分析表明,外源茉莉酸处理对pal基因表达有上调作用;高效液相色谱（HPLC）分析茉莉酸处理后辣椒素含量发现,外源茉莉酸可以促进辣椒素的合成。该研究将为pal基因转录调控和功能研究提供参考。     

受青枯菌诱导表达的马铃薯转录因子类StWRKY8的克隆与表达分析

【目的】从接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）的马铃薯中薯3号（Solanum tuberosum）中克隆类StWRKY8部分序列,分析其序列结构特征,研究该基因在感、抗病基因型马铃薯中受诱导的差异表达模式及其不同的组织表达定位。【方法】分别培养抗病基因型马铃薯ED13、感病基因型中薯3号至9-10叶期,以伤根浸菌法接种青枯菌菌株PO41。提取叶片总RNA,反转录为cDNA,使用PCR筛选cDNA差减试剂盒构建消减文库,筛选出384个阳性克隆作为原始SMART cDNA文库,采用5'-RACE法根据SMART-RACE cDNA扩增试剂盒说明克隆全长类StWRKY8。并分别应用生物信息学软件BioEdit、BLAST、MEGA 5.0分析类StWRKY8的基因序列、序列相似性比对以及建立系统进化树。利用ProtParam、ProtScale、SWISS-MODEL、NetPhos2.0 Server、WOLF PSORT、TargetP1.1 Server等在线服务器预测类StWRKY8的理化特性、三级结构、磷酸化位点以及亚细胞定位。提取马铃薯ED13、中薯3号接种青枯菌后的叶片总RNA,采样时间点分别为处理后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和6 d,运用反转录PCR和荧光定量PCR检测类StWRKY8的表达情况。以类StWRKY特异PCR产物制备地高辛标记探针,取材料茎、叶组织制作石蜡切片,并与标记探针进行原位杂交,定位其组织表达。【结果】获得了类StWRKY8 cDNA部分序列,长563 bp,包括一个完整开放阅读框258 bp,编码85个氨基酸。类StWRKY8属于第二类WRKY,锌指结构类型为C₂H₂,具有一个典型的WRKY保守结构域。其氨基酸序列与茄科（Solanaceae）其他成员具有高度同源性,与马铃薯转录因子StWRKY8相似性高达98%。预测类StWRKY8等电点约为9.1,半衰期大于5.5 h,为水溶性蛋白,其三维结构为非球状分子,含有3个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞内。类StWRKY8受青枯菌诱导后表达上调,且在感、抗病基因型马铃薯中表达有差异。类StWRKY8在感病基因型马铃薯接种青枯菌6 h内表达量较低,而在抗病基因型马铃薯接种青枯菌6 h内高强度表达。该基因主要在茎叶维管束系统的韧皮部表达,具有组织特异性。【结论】类StWRKY8具有转录因子的一般结构特征,受青枯菌等病菌的诱导表达,同时受寄主植物固有抗性的影响,在感、抗病基因型中表达模式不同。推测其在植物防御反应中发挥作用并参与机体调控。     

鳞头犬牙南极鱼atp6v0c基因在HeLa细胞中抗寒功能的研究

为探求南极鱼ATP酶类在低温适应下的作用,从鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawsoni的c DNA文库中克隆atp6v0c基因(dmatp6v0c),并转染到He La细胞中,通过流式细胞仪检测细胞在低温胁迫下(10℃)的死亡率,获得了dmatp6v0c基因的全部编码序列,其长度为462 bp,并将其插入到真核表达载体pc DNA3.1(-)上用于体外表达。结果表明,与对照组相比,在低温胁迫下,过表达dmatp6v0c基因的He La细胞死亡率从(19.23±1.87)%显著降低到(8.13±0.04)%(P0.05)。研究表明,在低温胁迫下dmatp6v0c基因过表达能显著降低He La细胞的死亡率,试验结果可为dmatp6v0c基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供理论依据。