仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。     

山羊小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,至10代山羊小肠上皮细胞质变大,细胞几乎无法增殖,细胞开始凋亡。综上所述,采用组织块接种能够获得山羊小肠上皮细胞并正常传至第10代,可为研究山羊小肠上皮细胞营养物质吸收和调控机理提供细胞素材。     

山羊输卵管上皮细胞的分离与培养

【目的】分离并培养山羊输卵管上皮细胞,研究其生长特性。【方法】采用胰酶、胶原酶及机械刮取方法分离输卵管上皮细胞并分析培养效果;选择免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定;向培养液中添加下丘脑粗提物、胰岛素、EGF和血清,探讨其对输卵管上皮细胞体外培养的影响。【结果】胰酶对山羊输卵管上皮细胞的分离效果较差,胶原酶次之,机械刮取方法较好。机械刮取法分离的细胞以细胞团居多,接种后8~12 h开始贴壁生长,生长2~3d细胞呈现明显的铺路石形态。免疫细胞化学染色显示,细胞角蛋白阳性率在95%以上。上皮细胞培养体系中含少量血清及人EGF、胰岛素,能有效促进原代和传代输卵管上皮细胞的生长,以体积分数5%血清+EGF的培养效果较好。【结论】采用机械刮取法分离培养的输卵管上皮细胞,在体外可连续传到第8代,传代细胞活性强、纯度高,可为输卵管上皮细胞相关功能的研究提供材料。     

鸡肝原代细胞药物代谢模型的建立与优化

[目的]建立成年鸡原代肝细胞的药物代谢模型并对其进行优化。[方法]以改进的二步灌流法分离8~12周龄的雄性黄羽鸡肝细胞,比较在不同细胞基础培养液条件下鸡肝细胞体外培养的情况,利用倒置显微镜观察肝细胞的形态,利用MTT检测法绘制生长曲线,测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,用q PCR和Western blot测定肝细胞中CYP450酶亚型CYP1A4、CYP1A5和CYP3A37 mRNA相对表达水平和3种酶蛋白的表达量。[结果]离体灌流操作简便,获得的细胞存活率高达90%以上;用含0.5 mg·L-1牛胰岛素、10 g·L-1双抗(100 U·m L-1青霉素和链霉素)和体积分数为10%胎牛血清的DMEM基础培养液体外培养鸡肝细胞,贴壁培养时可见到肝细胞较为明显的分化过程,贴壁后呈上皮细胞样生长,多角形,胞浆内容物均匀丰富,细胞核清晰透亮,少数有双核,细胞生长状态良好。生长曲线和LDH活性测定结果显示:培养3~5 d时细胞状态稳定,并且在肝原代细胞培养的8 d内,CYP1A4、CYP1A5和CYP3A37 mRNA相对表达水平和蛋白的表达量没有显著差异。[结论]以改进的二步灌流法分离鸡肝细胞操作简便,分离的鸡肝原代细胞存活率高,用含0.5 mg·L-1胰岛素、100 U·m L-1青霉素、100μg·m L-1链霉素和10%胎牛血清的DMEM基础培养液体外培养鸡肝原代细胞效果最好,培养3~5 d是进行体外药物代谢等试验的最佳时机。     

丁酸对瘤胃上皮细胞生长和凋亡的影响

采用体外法探讨不同浓度丁酸对瘤胃上皮细胞生长及凋亡的影响。不同浓度丁酸(0,20,40,60,80,100,120,140 mmol/L)处理瘤胃上皮细胞不同时间(4,6,8,10 h)后,MTT法检测各处理组的细胞活力,再选择适宜处理用于TUNEL法、DNA ladder法、流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明:随着丁酸添加浓度的升高,瘤胃上皮细胞的相对细胞活力先增加后降低,20 mmol/L丁酸能促进瘤胃上皮细胞的生长,40~140 mmol/L丁酸则降低了瘤胃上皮细胞的细胞活力。添加120 mmol/L丁酸培养6 h诱导了瘤胃上皮细胞发生凋亡,总凋亡指数为28.4%,显著(P0.05)高于对照组(24.1%)。低浓度丁酸可促进瘤胃上皮细胞生长,而高浓度丁酸则促进细胞发生凋亡。     

福寿螺组织细胞原代培养及染色体核型分析

无菌分离取得福寿螺肌肉、外套膜、肾脏及脑组织,分别采用胰酶消化法和研磨法进行组织细胞分离,选取DMEM、F12和改良1640培养基分别进行细胞原代培养,光镜下观察细胞的生长状态,MTT法测定细胞活性。细胞培养一定时间后进行染色体制备及染色体核型分析。结果表明,福寿螺组织细胞在不同的培养基培养下活力具有明显差异,用含水解乳蛋白的DMEM培养基培养的福寿螺外套膜和斧足组织细胞活力较好;用M199培养基培养的福寿螺斧外套膜和脑组织细胞活力较好。核型分析结果表明福寿螺染色体为二倍体(2n=28,NF=56),核型为2B型,核型不对称系数为66.4%。     

犬乳腺上皮细胞的分离鉴定及培养方法优化

为建立一种快速分离犬原代乳腺上皮细胞的培养方案，本研究旨在从健康泌乳金毛犬的乳汁中分离原代乳腺上皮细胞，接种于两种不同的培养基后传代培养，探讨不同培养基下细胞的生物学特征，提供犬乳腺上皮细胞简单便捷的分离措施及适宜的培养方法。选取泌乳一周的金毛犬在无菌条件下收集乳汁，离心处理后得到乳腺上皮细胞，分别用完全培养基和基础培养基接种培养，经形态学对比观察，间接免疫荧光检测角蛋白8(Cytokeratin 8)表达情况，绘制两种培养基培养下的第3代乳腺上皮细胞生长曲线；探讨完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞的冻存复苏活力。结果表明:1)乳汁分离可得到大量细胞团块，分别接种两种培养基后都会出现“煎蛋样”贴壁细胞，消化传代后两者均有Cytokeratin 8的高度表达；2)接种于基础培养基的细胞前期以聚集在一起的圆形单克隆细胞团块为主，传至第4代仅有少量细胞存活，细胞随着培养时间增加而状态变差，死亡细胞增多；接种于完全培养基的细胞整体呈“鹅卵石铺路样”成片生长，随着传代次数增加细胞状态稳定，细胞生长曲线呈现“S”形；3)完全培养基培养的第6代乳腺上皮细胞冻存复苏后能快速贴壁并分裂增殖。综上，乳汁分离法成功分离犬乳腺上皮细胞，且与基础培养基相比，完全培养基可以更好地维持细胞活性，促进细胞增殖分裂，且不影响细胞冻存后复苏的活力，为后期快速分离犬乳腺上皮细胞提供较优的培养方案。     

黄牛输卵管上皮细胞的体外分离与培养

为探讨适用于黄牛输卵管单层上皮细胞的培养方法，采用机械剪取及0．25％胰酶消化的方法分离获得上皮细胞，取对数生长期细胞进行MTT比色实验检测细胞活力和生长速度；台盼蓝排斥试验检测活细胞数。结果表明利用机械剪取及0．25％胰酶消化的方法经细胞形态观察可以分离获得黄牛输卵管上皮单层细胞；台盼蓝排斥实验经计数计算传代的上皮细胞活力在90％以上；经冷冻后再解冻的输卵管上皮细胞活力在75％以上。该研究探索建立了一套较为适宜的黄牛输卵管上皮细胞分离、培养模型。     

人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化

为优化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)原代及传代的培养方法,建立一种简便且能够获得数量较多及活力良好的HUVEC培养体系。分离脐静脉并插管,用0.1%的II型胶原酶灌注消化分离内皮细胞。M199完全培养基悬浮并接种于细胞培养瓶,37℃,5%CO2培养。待细胞铺满80%时,0.25%胰酶-EDTA消化传代培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,姬姆萨染色法鉴定内皮细胞的形态,vWF因子相关抗原免疫荧光法鉴定内皮细胞。比较不同胶原酶消化时间、不同接种密度、不同胰酶消化时间、不同培养基组分对细胞得率、形态和纯度的影响。结果表明,原代培养时,II型胶原酶最佳消化时间为15min,最佳接种密度为1×106 mL-1;传代培养时,胰酶最佳消化时间为2min。倒置显微镜下观察和姬姆萨染色结果显示,贴壁内皮细胞呈长梭形,且呈单层铺路石状排列。免疫荧光检测结果表明,细胞胞浆呈绿色荧光,为vWF因子阳性细胞,DAPI衬染细胞核呈蓝色,显示内皮细胞纯度接近100%。本实验成功建立了HUVEC原代分离培养的优化体系,纯度高、活力好,为后续研究做好了准备。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.