检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.     

猪FMDV的VP1结构蛋白特异性抗体间接ELISA的建立

以纯化的FMDV-VP1融合蛋白为抗原,建立了猪口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白间接ELISA检测方法.抗原包被浓度为10μg·mL-1时,血清最佳稀释度为1:40,通过测定30份FMDV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准.结果表明,该方法特异性强,重复性好;对216份送检猪血清用EUSA检测,阳性检出率为31.5%,阴性检出率为68.5%,与HA符合率为96.2%,表明建立的VP1结构蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性.     

斑点免疫金渗滤法诊断猪蛔虫病

[目的]探讨斑点免疫金渗滤法诊断猪蛔虫病的可行性,为制备诊断猪蛔虫病试剂盒提供参考依据。[方法]采用猪蛔虫的重组蛋白AS16抗原和胶体金标记葡萄球菌蛋白A（SPA）,根据免疫渗滤原理,建立抗猪蛔虫抗体的斑点金免疫渗滤检测法。[结果]斑点免疫金渗滤法检测1200份猪血清样本中猪蛔虫抗体,检出阳性率为25.00%,而琼脂扩散试验（AGP）阳性检出率为15.00%。[结论]斑点金免疫渗滤检测法具有操作简便,灵敏度高,特异性强的优点,可用于猪蛔虫病的快速检测。     

非洲猪瘟病毒无标签重组K205R抗原制备与应用

为建立敏感、特异的非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体检测方法,将ASFV K205R基因与类弹性蛋白多肽(ELP)进行融合表达,用相变循环纯化ELP-K205R融合蛋白,用烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶活性包涵体切除ELP标签,用相变循环回收K205R蛋白,用抗体阳性血清对重组K205R蛋白进行ELISA鉴定。结果表明:重组大肠埃希菌能正确表达ELP-K205R融合蛋白,相变循环纯化的融合蛋白纯度大于80%; TEV蛋白酶活性包涵体能有效切割ELP标签,回收的重组K205R蛋白纯度大于95%,能被特异抗体阳性血清识别;重组K205R抗原与抗体阴性猪血清反应阴性,与抗体阳性猪血清反应阳性,D_(450 nm)值与血清稀释倍数具有线性相关性。用重组K205R抗原对已知猪血清进行ELISA检测,结果显示24份ASFV抗体阳性血清为检测阳性, 24份ASFV抗体阴性血清为检测阴性,检测符合率为100%。这一研究提示制备的无标签重组K205R抗原可用于ASFV抗体检测。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定

[目的] 研究口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因的表达及反应原性鉴定。[方法] 以含有FMDV 3ABC基因的质粒为模板,应用RT-PCR技术扩增口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因并进行序列测定,将3AB基因克隆至表达载体pET-28a（＋）,选取阳性克隆转化BL21感受态用IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定与Western-bolt检测分析。[结果] 经SDS-PAGE和Western-bolt分析表明,在大肠杆菌中成功表达了3AB蛋白,表达的目的蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。[结论] 该项研究为应用以重组FMDV非结构蛋白为抗原建立感染和免疫动物的鉴别诊断方法提供了依据。     

猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接 ELISA 方法的建立

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接ELISA方法的建立(英文)

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

2种口蹄疫O型抗体阻断ELISA检测试剂盒应用比较

为评估2种常用口蹄疫O型抗体检测试剂盒的性能差异,对2020年春季随机抽检的3家规模养殖场提供的60份猪血清分别用液相阻断ELISA试剂盒和抗体阻断(固相)ELISA试剂盒进行了检测,并比较了2种试剂盒的阳性检出率和符合率。结果表明,2种方法检测结果总符合率为91.67%,符合程度高。在基层畜牧兽医部门日常定性检测中,推荐使用抗体阻断(固相)ELISA检测试剂盒。     

资兴市州门司镇口蹄疫血清学抗体监测与分析

为掌握资兴市州门司镇家畜口蹄疫的免疫状况与流行情况,对2016年州门司镇采集的126份牛、羊、猪血清样品进行O型口蹄疫抗体和口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的检测与分析。结果显示,资兴市州门司镇牛、羊、猪O型口蹄疫的免疫合格率分别为100%、100%、98.11%,牛、羊、猪口蹄疫野毒抗体阳性率均为0%。说明资兴市州门司镇家畜O型口蹄疫疫苗免疫效果整体较好,暂无口蹄疫病毒野毒株的流行。     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒#br#

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP 抗体的 ELISA 方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA 试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg•mL-1; 检测199 份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

Development of a Synthetic Peptide ELISA Assay for the Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus Nonstructural Protein Antibodies

In order to develop an ELISA assay with synthetic peptides for the detection of antibody to the nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus, specific peptides were synthesized by a solid-phase method according to FMDV NSPs B-cell epitopes, and were conjugated to carrier protein BSA. An ELISA system was developed to detect FMDV NSPs antibody with the conjugated proteins as the coating antigen. The optimal coating concentration of the antigen was determined as 2.5 μg mL-1. The comparative study of this assay with UBI NSP ELISA kit and national commercial 3ABC ELISA kit in the detection of 199 serum samples showed that they were very coincident, and the identity rates were 96.48 and 97.48%, respectively. The development of ELISA using the synthetic peptides as coating antigen is specific, reproducible, stable, and easy, and can be used to differentiate FMDV infected pigs from immunized pigs.     

河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒感染状态检测

为了解河南某鸡场地方品种鸡禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)感染状态,采集该鸡场绿壳蛋鸡、青脚麻鸡和固始鸡的泄殖腔棉拭子、蛋清和血清,利用ELISA方法检测泄殖腔棉拭子、蛋清和血清样品中的ALV-p27抗原及血清样品中ALV-A/B和ALV-J抗体的水平,同时采集其血液接种DF-1细胞进行外源性ALV的分离鉴定。结果表明,绿壳蛋鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的ALV-p27抗原阳性率分别为23.55%、11.96%和26.63%,血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为30.43%和16.85%,外源性ALV的分离阳性率为13.04%;青脚麻鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为10.99%、5.43%和22.83%,血清中ALV-A/B和ALV-J抗体的阳性率分别为18.48%和6.52%,外源性ALV的分离阳性率为8.00%;固始鸡泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中抗原阳性率分别为21.07%、12.32%和25.00%,血清中ALVA/B和ALV-J抗体的阳性率分别为28.26%和17.39%,外源性ALV的分离阳性率为12.50%。表明3个地方品种鸡都不同程度地感染外源性ALV,且可能存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种亚群同时感染。     

口蹄疫病毒3ABC、3AB、3BC基因克隆、表达及其抗体消长规律的研究

 成功克隆了FMDV太保毒株3ABC全基因片段,并将ABC、3AB、3BC片段插入pGEX-4T-1表达载体构建了重组表达质粒,经Western blotting 分析表明,表达的3ABC、3AB蛋白与FMDV阳性血清有反应性,表达的3BC蛋白反应性差。以纯化的3ABC、3AB表达蛋白为抗原建立间接ELISA方法,对背景清楚的试验牛血清进行检测。结果3ABC、3AB表达蛋白与空白对照组(C组)、灭活疫苗反复免疫组(CI组)和部分免疫后攻毒组(I组)牛血清均不发生反应,与未免疫直接攻毒组(D组)和部分I组血清均     

牛呼吸道合胞体病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立及应用

 【目的】以纯化的牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)HJ株重组N蛋白作为包被抗原,对各项条件进行优化,确定判定标准,建立检测BRSV抗体的间接ELISA方法。【方法】将已构建的重组菌BL21(DE3)进行诱导表达,获得重组N蛋白。利用电洗脱法对表达产物进行纯化,并用Western blot对表达产物进行鉴定。以纯化后的重组N蛋白作为诊断抗原,对ELISA反应条件进行优化,初步建立检测BRSV抗体的间接ELISA诊断方法。【结果】成功表达并纯化了BRSV HJ株重组N蛋白,Western blot检测结果证明表达产物具有良好的反应原性。以重组N蛋白作为诊断抗原,建立了间接ELISA诊断方法。交叉试验结果表明重组N蛋白与牛无浆体病(Anaplasmosis)、牛传染性鼻气管炎(IBRV)和牛副流感(BPIV)阳性血清均不发生交叉反应。与中和试验(SNT)相比较,该方法的特异性、敏感性和符合率分别为85.0%、90.9%和87.7%。采用本试验建立的间接ELISA方法对黑龙江省的牡丹江、佳木斯、鹤岗和大庆4个地区牛场的600份牛血清进行了检测,结果表明,黑龙江省部分地区BRSV的抗体阳性率为27.33%。【结论】本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,利用该方法初步证实黑龙江省部分地区存在牛呼吸道合胞体病。这一研究为牛呼吸道合胞体病诊断试剂盒的研制奠定了基础,并为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。     

湖南省猪瘟流行情况的血清学调查

采用ELISA对湖南省规模猪场送检的953份血清进行了猪瘟抗体的检测,对305个病例(场次)进行了猪瘟抗原的检测。结果表明未免疫猪的抗体阳性率仅为2%,免疫猪的抗体阳性率为55.59%;305个病例(场次)其猪瘟抗原的阳性率为61.97%。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL~(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。