透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因（vgb）克隆到融合表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21（DE3）表达。重组蛋白在30℃诱导获得可溶表达。利用Ni^2＋亲和层析对重组蛋白进行了纯化，得到重组的透明颠菌血红蛋白，蛋白呈红色。实验现象显示重组蛋白与血红索相结合。紫外光区和可见光区波长扫描分析显示：蛋白粗提物和纯化后的血红蛋白在230nm和413nm都有强吸收峰，初步表明，尽管重组蛋白比天然蛋白多36个氨基酸，重组蛋白仍然具有生理活性。诱导后4h和6h的培养液氨基乙酰丙酸含量分别达到17mg／L和21mg／L。说明重组蛋白的表达明显促进了体内heme合成途径。     

桑树低温诱导蛋白基因（Wap25）的原核表达

以pGEX-4T-2为载体构建了桑树低温诱导蛋白基因（wap25）的重组表达质粒,转化受体菌Ecoli BI21。经IPTG诱导后,基因产物在大肠杆菌中得到了有效表达。为了提高表达效果,我们从不同表达载体、诱导时间和诱导温度等方面对目的蛋白的表达条件进行了优化,用SDS-PAGE电泳检测,结果表明30℃条件下经0．5mmol／L的IPTG诱导8h为最优诱导条件。     

乙型脑炎病毒NS1蛋白的可溶性表达与抗原性分析

为获得可溶性表达的乙型脑炎病毒(JEV)NS1蛋白,将编码JEV SA14-14-2株NS1蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-c5X中,构建重组融合表达质粒pc5X-NS1;用重组质粒转化宿主菌ER2523后,经IPTG诱导得到可溶性的融合蛋白MBP-NS1;优化诱导表达条件,于28℃、0.3 mmol/L IPTG诱导4 h;最后融合蛋白经直链淀粉树脂柱纯化。结果表明:重组融合蛋白MBP-NS1具有良好的抗原性和特异性。     

蚓激酶成熟肽的原核表达及纯化

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因，并按相应的阅读框架克隆入表达载体pGEX-4T中谷胱甘肽S-转移酶（GST）的下游。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta株，分别在1．0mmol／LIPTG、37℃和0．1mmol／L IPTG、28℃条件下诱导，蚓激酶成熟肽-GST融合蛋白获得了高效表达，且后者得到了可溶性蛋白。经SDS-PAGE证实所表达的融合蛋白产物相对分子量与预期的53kD相符。并且以等电点和亲和层析的方法对表达出的可溶性蛋白进行了纯化。     

牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体，即pGEX-BoPrP（23～242）、pGEX—BoPrP（100～242）、pGEX—CaPrP（25～241）和pGEX—CaPrP（93～241），经转化E．coli BL21（DE3），成功地获得了重组菌E．coli BoPrP（23～242）、E．coli BoPrP（100～242）、E．coli CaPrP（25～241）和E．coli CaPrP（93～241），分别可表达大小约为50．2、41．7、49．9和42．4ku的融合蛋白。各重组菌经1．0mmol／L的IPTG于37℃诱导5～6h可产生占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。免疫印迹分析表明，除融合蛋白GST—BoPrP（100～242）外，GST—BoPrP（23～242）、GST—CaPrP（25～241）和GST—CaPrP（93～241）均可与抗牛单克隆抗体4C11反应，显示中国黄牛PrP^c与牦牛和双峰驼PrP^c具有共同的抗原成分。     

重组犬IL-2在原核细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术克隆犬IL-2基因，并插入到原核表达载体PJLA605中，构建pRL-CaIL-2表达质粒；采用M9培养基摇瓶发酵，确定诱导时机和诱导表达时间。结果表明：工程菌pRL-CaIL-2在30C培养至对数生长后期（OD600为1．5）42C诱导4h时。菌体收得量湿重达17．8g／L，目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的29．7％。外源基因在该基因工程菌中得到了高效表达。     

柔嫩艾美球虫扬州株S07抗原基因表达条件的研究

通过RT—PCR扩增柔嫩艾美球虫YZ株折光体SO7抗原基因，并进行克隆和测序。将不舍信号肽编码区片段的S07基因克隆入表达载体pGEX6p-1谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游，构建表达质粒pGEX6p-1-SO7，转化宿主菌BL21，获得重组菌。通过建立生长曲线，对诱导条件的摸索，根据SDS—PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件。通过融合蛋白切胶免疫小鼠制备超免疫血清，经间接EL-ISA检测其与E。tenella子孢子抗原反应的特异性。结果显示，诱导时机和诱导时间是影响表达的主要因素，诱导温度、1PTG浓度次之；诱导时机以3h为最佳，诱导时间以4．5h为最佳；诱导温度以37℃最佳，0．008～1．000mmol／L的IPTG对表达量的影响不大。在优化的表达条件下，表达产物主要以包涵体存在，表达量占菌体总蛋白的37．5％。间接ELISA结果表明融合蛋白具有一定的免疫原性，保留了天然蛋白的部分抗原性。     

马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

牛朊蛋白单氨基酸变异体的原核表达

应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒，即pGEX-BoPrP(93～241)、pGEX-BoPrP(93～241)(S154N)、pGEX-BoPrP(93～241)(A129V)和pGEX-BoPrP(93～241)(Q234R)。经转化E．coli BL21(DE3)．均表达了预期大小约为42．4ku的融合蛋白。在优化的诱导表达条件下，各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30％～45％的融合蛋白。经免疫印迹检查，所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11反应。表明，单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位。     

日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶基因的表达及其免疫保护试验

为研究日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶（SjPP）的免疫功能，构建了原核表达重组质粒pET28a（＋）-SjPP，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）进行诱导表达，并用重组蛋白进行了小鼠免疫保护试验，免疫剂量为每次20μg／只，共免疫3次。结果表明，pET28a（＋）-siPP／BL21（DE3）在0．1mmol／L IPTG诱导2h时，每1g菌体可产生17．8mg以包涵体形式存在的重组蛋白；重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了高效价的血清特异性IgG抗体，并获得了部分减虫率、肝组织减卵率和显著的粪便减卵率，具有一定的免疫保护作用。     

抗菌肽Cecropin P1基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条抗菌肽Cecropin P1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽Cecropin P1基因,将此基因克隆到原核表达载体pMAL-p2X中,然后将重组质粒pMAL-p2X-Cecropin P1转化E.coliTB1,经IPTG诱导进行融合表达,以Amylose Resin亲和层析纯化。通过SDS-PAGE分析,融合蛋白MBP-Cecropin P1表达与纯化成功。抗菌肽Cecropin P1基因的成功表达为进一步研究其抗菌活性、抗菌机理及应用研究打下基础。     

动物RNA病毒载体对外源基因的表达

重组DNA技术的出现，为分析、改造生物基因组提供了先进的技术手段，人们可在分子水平上深入研究和阐述基因组结构和功能以及两者间的关系。病毒是自然界中基因组相对较小的微生物，人们对其结构的了解较为容易，但其基因组比其他生物更易发生突变，每年都有许多新病毒或病毒变种出现。病毒基因组这种多变的特点为人们在分子水平上对病毒进行缺失、     

细胞黏附分子1（ICAM-1）ScFv基因原核载体的构建及表达

应用PCR技术扩增ICAM-1ScFv基因,经纯化测序,得到约750bp的核苷酸片段,并构建了原核重组表达质粒pET20b-ICAM-1ScFv。将重组质粒转化至表达菌BL21（DE3）中,诱导后的SDS-PAGE分析显示,pET20b-ICAM-1ScFv表达量占菌体蛋白总量的18.4%。本试验将重组蛋白的表达条件进行优化,结果表明,ICAM-1ScFv蛋白在pET20b表达载体中的最佳表达条件为37℃诱导5h。     

牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

为了研究牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶基因(Lip)的生物学特性及其功能,试验构建了Lip-pEGFP融合基因的真核表达载体,利用脂质体(lipofectamine2000)将其转染到Hela细胞中,用荧光显微镜检测GFP在细胞中的表达情况。结果显示,重组Lip-pEGFP载体在Hela细胞中获得了高效表达,且能够稳定传代,为进一步研究Lip的生物学功能及其在牛结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。     

猪食欲肽受体2基因真核表达质粒的构建及其表达

构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.1(+)质粒中。用限制性内切酶酶切分析及测序分析证明构建成功后,用脂质体法转染HEK293T细胞,蛋白质印迹法检测OX2R基因的表达。结果,成功构建了带有myc标签和Kozak序列的pcDNA3.1(+)-myc/OX2R重组质粒,蛋白质印迹法检测该质粒可在真核细胞中表达。本研究为将来研究猪食欲肽受体2的功能奠定基础。     

锌与基因表达

锌是动植物体组成的必需成分,也是动植物体生长发育过程中必需的微量元素。在动物的生长发育过程中,锌参与不同的细胞进程,包括催化作用、基因表达和细胞凋亡和氧化应激的抑制剂犤1犦。例如,锌至少是60～80种酶的组成部分犤2犦,它在酶中主要是提供结构或催化作用。碳酸酐酶的活     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。