猪戊型肝炎病毒ORF3基因的克隆与原核表达

为了表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行研究,采用RT-PCR方法扩增猪戊型肝炎病毒(SHEV)ORF3完整基因,将扩增产物插入pMD19-T载体,再亚克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了pET-32a(+)-ORF3表达载体,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,同时对诱导表达条件进行筛选,并用SDS-PAGE和免疫印迹等方法分析鉴定表达产物。结果表明,成功扩增到345bp的目的基因片段,表达载体pET-32a(+)-ORF3转入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导,成功表达了ORF3基因编码的蛋白,当IPTG浓度为1mmol/L,诱导时间为6h时,该基因在E.coli BL21(DE3)中表达量最高。表达产物的分子质量约为29.6ku,与预期目的蛋白分子质量相符。表达的蛋白既有包涵体形式,也有可溶性形式。经Western blot检测,表达的目的蛋白能与SHEV阳性血清发生特异性反应。     

水牛ghrelin基因原核表达载体构建与蛋白表达

为了研究水牛ghrelin基因的结构与功能,本试验对水牛ghrelin基因进行原核表达载体构建与融合蛋白表达条件的优化。采用RT-PCR方法从水牛胃组织的总RNA中扩增出ghrelin编码区,连接到pRSET-a载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆子,用IPTG进行诱导表达条件的优化。结果表明,成功构建原核表达载体pRSET-a-ghrelin,在2 mmol/L IPTG,37℃的条件下诱导表达4 h,水牛ghrelin重组蛋白可成功获得表达,经SDS-PAGE鉴定发现,ghrelin融合蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 ku,其表达量占总菌体蛋白量的35%。本试验结果为进一步研究水牛ghrelin基因的结构和功能提供有价值的生物学信息。     

家蚕细胞色素P450 CYP337A1的原核表达

以含有CYP337A1基因完全编码框的克隆载体质粒DNA为模板进行PCR扩增,产物经TA克隆测序鉴定后,亚克隆至原核融合表达载体PET50（b）（含有编码64．3kD的Nus．Tag蛋白标签）中,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达。利用SDS-PAGE方法,以空载和未诱导菌体作对照,对细菌总蛋白进行电泳分析,结果表明：经1mmol／L IPTG诱导2h后,即能看到1条大约120kD的蛋白质特异带,与预计大小一致。进一步利用不同时间、不同温度以及不同浓度的IPTG进行诱导结果比较,发现在诱导时间为2h,温度为32℃,IPTG浓度为0．6mmol／L的诱导条件下,融合蛋白表达量最大。该实验为利用该基因的蛋白产物进行功能分析创造了条件。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

为了表达并纯化猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)Cap蛋白,试验将ORF2基因的密码子改造为大肠杆菌嗜好的密码子,但编码的氨基酸序列不变。合成优化后将ORF2基因全部基因序列,克隆于pET-30a原核表达载体并转化至大肠杆菌BL21中,经PCR和测序鉴定阳性克隆后,采用IPTG诱导表达目的蛋白。优化蛋白表达条件,采用Ni-NTA亲和层析胶纯化目的蛋白。结果表明:基因序列合成正确,无点突变。重组质粒成功转化入大肠杆菌BL21中,经诱导表达出现约37 ku的蛋白条带,与预期分子量大小一致。优化表达条件后,加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG诱导6 h,表达产物含量最高。经Western-blot检测,能被PCV-2抗体阳性血清结合。说明成功构建了PCV-2 Cap蛋白的原核表达质粒pET-30a-ORF2,优化了表达条件并纯化出目的蛋白。     

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的原核表达

血凝素(hemagglutinin,HA)是禽流感病毒的主要抗原之一,原核表达HA是该抗原特性研究和疫苗制备的关键。利用分子生物学方法构建H5N1亚型的禽流感病毒HA基因原核表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta菌株,用不同IPTG浓度和时间诱导HA表达,检测蛋白表达量,分析不同诱导条件对HA表达效率的影响,以确定最佳诱导条件。重组表达载体pET32a-HA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,获得预期大小的DNA片段,说明HA基因成功插入质粒pET32a。Western blot检测结果表明,IPTG诱导重组菌株成功表达HA蛋白,当诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为6h时,HA蛋白表达量最高。研究结果为HA抗原制备及禽流感疫苗的研究奠定基础。     

大骨鸡HSP70蛋白的表达、纯化及质量检测

旨在构建鸡热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表达质粒p ColdⅡ-HSP70,诱导表达、纯化后检测HSP70蛋白的质量。将目的基因扩增后克隆至表达载体p Cold II,构建重组载体p ColdⅡ-HSP70,在2种大肠杆菌菌株(BL21(DE3)和Rosetta(DE3)p Lys S中经IPTG在不同温度与不同浓度条件下诱导表达并纯化。经SEC-FPLC和HPLC进行纯度鉴定,采用鲎试剂检测蛋白内毒素含量(将HSP70蛋白按1 200、600、120倍稀释);Western blot及质谱方法检测蛋白分子量。结果显示:酶切和测序结果均证实HSP70表达载体构建正确,可诱导表达。经IPTG诱导表达后确定BL21(DE3)在37℃条件下表达蛋白效果最佳,经检测HSP70蛋白的相对分子质量为71 988.04,蛋白纯度大于90%,内毒素小于500 Eu/mg。结果表明:成功构建了大骨鸡HSP70基因的表达载体,获得了纯化的HSP70蛋白,为进一步研究HSP70在热应激中的作用机制提供了基础。     

家兔BMP7基因的原核表达及其适宜表达条件探索

为实现家兔BMP7基因原核表达及探索适宜的表达条件,采用PCR技术从pMD18-T-BMP7重组质粒中扩增获得BMP7基因成熟肽片段(mBMP7),构建原核表达工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS,并比较温度、IPTG浓度、诱导时间等因素对目的蛋白表达的影响。结果表明,mBMP7原核表达载体构建正确;工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导均可表达含有家兔BMP7成熟肽的34KDa的融合蛋白,表达产物约占菌体总蛋白的30%。在37℃、0.75 mM IPTG以及诱导150 min时,能取得较高的目的蛋白表达量;在20℃低温条件下,IPTG浓度和诱导表达时间应分别以0.20 mM和7 h为宜;另外,目的蛋白表达对工程菌生长无明显的不利影响。因此,成功地构建了家兔BMP7基因工程菌,并确定了适宜的表达条件,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

新型抗菌肽Hadrurin基因的克隆与表达

Hadrurin是一种分离自毒蝎的高活性抗菌肽,对多种细菌有较强抑制活性.本试验构建Hadrurin全基因并在其两端加入了可切除的保护性多肽基因;再酶切Hadrurin基因产生黏性末端并连入pET-32a(+)原核表达载体;IPTG诱导表达抗菌肽蛋白,亲和层析纯化抗菌肽蛋白.结果表明,构建的Hadrurin全基因片段序列完全正确,连接进入pET-32a(+)表达载体的基因由0.1 mmol/L终浓度的IPTG诱导5 h可达到表达的高峰,重组蛋白经亲和层析可到达纯化的目的.     

蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素

将蛇毒类凝血酶基因(TLE)亚克隆到原核表达载体pMAL-p2X上,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达;同时采用不同的OD值、诱导时间I、PTG浓度和诱导温度对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因重组表达质粒pMAL-p2X进行了条件优化。研究发现,不同的诱导时间、IPTG诱导浓度和诱导温度与融合蛋白表达量有很大关系。SDS-PAGE结果显示,当OD值为0.5,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为37℃时,诱导3 h后蛋白表达量最高,超出此范围可使表达量显著减少。在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白量的66%。     

IPTG诱导浓度、时间对Asia I型口蹄疫病毒VP1蛋白表达的影响

将口蹄疫病毒VP1基因插入原核表达载体pET-28a中,转化至大肠杆菌BL21。用不同的IPTG浓度与不同诱导时间诱导菌株表达VP1蛋白,分析不同IPTG浓度及不同诱导时间对蛋白表达量的影响,以确定最佳表达条件。结果表明,在一定范围内,随IPTG浓度的增高,表达量并不会随之增大;而在菌体对数生长期内,随诱导时间的延长,表达量会随之增大。最后确定当IPTG浓度为3 mmol/L,诱导表达到最长时间9 h时,VP1蛋白表达量最大。     

致倦库蚊防御素基因的克隆与原核表达及蛋白纯化

以冈比亚按蚊防御素(Defensin)氨基酸序列为种子序列,在致倦库蚊EST库中查找相似序列。通过RT-PCR技术,克隆获得致倦库蚊防御素编码序列。将致倦库蚊防御素成熟肽基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+),构建致倦库蚊防御素重组表达质粒pET32a-DEF,导入大肠埃希菌Rosetta中表达,并比较不同IPTG浓度、不同诱导时间、不同诱导温度对重组基因表达的影响,以确定最佳诱导表达条件,重组蛋白经His-镍蛋白纯化柱纯化。结果表明,致倦库蚊防御素基因编码区全长300bp,编码99个氨基酸。pET32a-DEF最佳诱导表达条件为,IPTG浓度0.2mmol/L,诱导时间为4h,诱导温度为37℃,经纯化获得大小约29ku的重组蛋白,这为进一步研究该蛋白功能奠定了基础。     

奶山羊IL-22的原核表达

根据signal IP3.0信号肽分析软件分析结果,设计IL-22不含信号肽表达引物,PCR扩增获得奶山羊IL-22基因,连接表达载体pET-32a,重组质粒转化BL21感受态细胞。对阳性克隆进行诱导表达,对诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时间等条件进行优化,在最佳条件大量诱导蛋白表达。结果显示,在37℃、IPTG浓度为0.1mmol/L、诱导5 h可获得IL-22最大表达量,目的蛋白以包涵体形式存在,包涵体经洗涤、变性和复性,纯度可达90%以上。本研究为进一步探讨IL-22在奶山羊乳腺免疫中的作用奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达

为表达H9N2亚型禽流感病毒的HA1蛋白,从H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株中扩增其HA1基因片段,将扩增得到的HA1基因克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,转化到BL21 (DE3)中进行表达.结果表明,IPTG诱导融合蛋白表达条件确定最佳诱导时间为8h,IPTG最佳终浓度为0.8 mmol/L.经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达产物的分子质量约为61 ku.     

猪血管内皮细胞中分子伴侣Jiv9O基因的克隆与原核表达

克隆到猪Jiv90基因,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中表达.从猪血管内皮细胞中克隆到Jiv90基因,将其克隆到pET-32a载体上,构建出重组表达载体,经IPTG诱导表达.结果表明,本试验成功克隆了大小为693 bp的基因,重组质载体pET-32a-Jiv90所表达的蛋白在大肠埃希菌中以包涵体的形式存在,表达产物经S...     

小反刍兽疫病毒M蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗小反刍兽疫M蛋白多克隆抗体,提取小反刍兽疫病毒(PPRV,Nigeria 75/1疫苗株)总RNA,用RTPCR方法扩增M基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒进行酶切,回收目的片段后克隆于原核表达载体PGEX-4T-1,获得重组质粒PGEX-4T-1-M,转化大肠杆菌Transetta(DE3)并进行诱导表达,优化诱导蛋白表达条件,放大培养收获目的蛋白,并进行纯化,用纯化后的目的蛋白制备免疫原免疫昆明鼠制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。结果成功扩增出大小约为1 005bp(去掉终止密码子)的PPRV M基因;并构建了真核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导后目的蛋白以包涵体的形式表达,蛋白表达的最优条件为37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h;用经Ni-NTA纯化后的重组蛋白3次免疫昆明鼠后成功获得了PPRV M蛋白鼠源多克隆抗体,间接免疫荧光试验显示该多克隆抗体能够特异性识别非变性全长M蛋白。     

IPTG诱导浓度、时间及温度对重组促性腺激素释放激素基因表达的影响

以人工合成的促性腺激素释放激素(gonadotropinreleasinghormone,GnRH)/转运肽(TRS)基因与表达载体pGEX-6p-1相连的重组子(pGE-G)作为研究对象,转化大肠杆菌BL21(ED3)plyS。利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同IPTG诱导条件对于表达产物的影响,以确定最佳IPTG诱导条件。结果表明:融合蛋白大部分以包涵体的形式存在,诱导温度为30℃;IPTG浓度为0.2mmol/L时,可溶性融合蛋白GST-GnRH/TRS表达量最大。光密度扫描对表达产物进行初步定量,表明表达产物约占菌体总蛋白的33.3%。     

猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从已构建好的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku,表达量20%左右。经Western-blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

乙型脑炎病毒E蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达

利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析 E蛋白基因结构与功能的关系提供条件     

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因,构建原核表达载体p ET-MAVS220,转化感受态细胞Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达,重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L,37℃诱导6 h,重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000;该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应,效价可达1∶1 000,特异性良好。