表达鸡α干扰素重组酿酒酵母菌的构建与鉴定

通过构建鸡α干扰素真核表达载体,以获得能够表达鸡α干扰素的酵母工程菌株。首先根据GenBank公布的鸡α干扰素基因序列设计上、下游引物,以略阳乌鸡基因组DNA为模板,PCR扩增鸡α干扰素基因片段。然后,利用基因重组技术将鸡α-干扰素基因插入真核表达载体,通过菌落PCR和DNA测序确定目标载体,构建成功后转化至酿酒酵母AH109,再通过营养缺陷培养、质粒提取和PCR鉴定带JMB440-ChIFN-α载体的重组酵母菌株。最终通过酵母培养、总蛋白收集、SDS-PAGE电泳和Western blot等,确定鸡α干扰素基因能够与酵母菌株重组,并表达α干扰素,蛋白条带大小约为23ku,与预期结果一致,表明成功构建了表达鸡干扰素基因的工程酵母菌株。     

小鼠中年期和老年期睾丸组织转录组分析

为丰富小鼠睾丸组织转录组研究领域的基础数据,对中年期(180日龄)和老年期(360日龄)小鼠睾丸组织进行转录组测序分析,在中、老年期分别获得25 187 980个和28 840 576个可用Reads,比对到参考基因组上的Reads分别有18 861 721和22 355 657个,占总读数的74.88%和77.51%,并检测到中、老年期小鼠睾丸组织中分别有17 770和18 073个基因表达。以中年期为对照,老年期睾丸组织中下调基因122个,上调基因185个,其中可清楚注释的基因共285个。GO分析发现285个差异表达被归纳到生物过程、细胞组分与分子功能3个大类的25个小类,主要涉及膜、氧化还原过程、转运蛋白活性、生殖发育及衰老等。KEGG分析发现差异表达基因涉及139个信号通路,主要代谢通路为信号转导、脂代谢、碳水化合物代谢、内分泌系统和神经系统等生物学机制。差异表达基因中RPKM1的有57个,其所涉及信号通路主要为脂代谢、固醇类激素生成、TNF信号通路、补体系统、胰岛素和溶酶体等。     

H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的原核表达

血凝素(hemagglutinin,HA)是禽流感病毒的主要抗原之一,原核表达HA是该抗原特性研究和疫苗制备的关键。利用分子生物学方法构建H5N1亚型的禽流感病毒HA基因原核表达载体,转化至大肠埃希菌Rosetta菌株,用不同IPTG浓度和时间诱导HA表达,检测蛋白表达量,分析不同诱导条件对HA表达效率的影响,以确定最佳诱导条件。重组表达载体pET32a-HA经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定,获得预期大小的DNA片段,说明HA基因成功插入质粒pET32a。Western blot检测结果表明,IPTG诱导重组菌株成功表达HA蛋白,当诱导浓度为0.1mmol/L,诱导时间为6h时,HA蛋白表达量最高。研究结果为HA抗原制备及禽流感疫苗的研究奠定基础。     

酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白

通过酵母双杂交实验技术筛选小鼠VDR相互作用的蛋白质,评价不同蛋白与VDR的结合活性,以期获得基于互作影响雄性生殖能力基因。扩增小鼠VDR完整CDS序列,克隆至诱铒表达载体pGBKT7,经菌落PCR、DNA测序鉴定,获得重组载体pGBKT7-VDR。随后将重组载体转化至酿酒酵母AH109,并进行毒性和自激活检测;然后与含小鼠cDNA文库的Y187酵母杂交,获得阳性克隆,经HindⅢ酶切,测序分析VDR互作候选蛋白的核酸序列,再检测β-半乳糖苷酶活性,评价候选蛋白与VDR作用力的强弱。结果表明,从小鼠cDNA文库中获得12个与VDR互作的候选蛋白。初步检测到12个蛋白可能与VDR互作,其中3个蛋白因子可能与VDR结合并调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力。