猪嗜血支原体ORF9的全基因合成及原核表达

为原核表达猪嗜血支原体(M.haemosuis) ORF9蛋白,本研究根据GenBank登录的AJ504999的ORF9基因序列,采用重叠延伸PCR技术(SOE-PCR),选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计并合成4对寡核苷酸片段,人工合成ORF9基因.将其克隆于表达载体pET-32a中构建重组表达质粒pET-ORF9,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE和western blot鉴定表明,重组蛋白的分子量约为34 ku.     

猪圆环病毒2型Cap 蛋白部分基因序列与大肠杆菌LTB成熟肽基因的融合表达及免疫原性研究

为了获得猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)衣壳蛋白(Cap)基因3’端396 bp的片段与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)成熟肽编码区融合基因的高效表达,并检验重组蛋白的免疫保护效果。以含PCV-2全基因组的pMDT PCV-2质粒为模板,用PCR的方法扩增PCV-2 Cap基因,并将其克隆到pET28a( )中,构建得到pET-Cap质粒,利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切切下Cap基因3’末端396 bp的片段,插入到pET-LTB原核表达质粒LTB基因的3’末端,从而构建pET-LTB△Cap原核表达质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS后,用IPTG诱导重组菌,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测诱导物。表达产物经初步纯化后用昆明系小白鼠做免疫保护实验。结果表明:pET-LTB△Cap重组融合表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白分子量约为29Ku,表达量约占菌体蛋白的36.67%,融合蛋白能被PCV-2阳性血清识别。攻毒后,所有小鼠临床表现正常。用PCR检测有1/8的免疫小鼠感染了PCV-2,而对照组8只小鼠都感染了PCV-21。PCV-2 Cap基因3’端396 bp的片段与LTB基因融合能实现高效表达,表达产物免疫的小白鼠可抵抗PCV-2的攻击此研究为PCV-2基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni~(2 )离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。     

猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析

为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型修饰Cap蛋白基因的原核表达及纯化

目的：本研究基于原核表达系统表达猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）Cap蛋白。方法：PCV-2 ORF2基因编码的Cap蛋白含有能产生免疫反应的多个抗原表位,本研究针对Cap蛋白基因设计引物,去掉核定位信号肽的核苷酸序列克隆到原核表达载体pET-32a（＋）中,筛选重组菌并进行原核表达、鉴定及纯化。结果：纯化后的修饰Cap蛋白是能够与猪圆环病毒Ⅱ型的阳性血清发生特异性反应。结论：表达的重组修饰Cap蛋白可以作为标准抗原蛋白用于PCV-2的检测。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究

根据猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增PCV-2去核定位信号(nuclear localization signal,NLS)的Cap蛋白基因(oRF2),经Bam H Ⅰ/HindⅢ双酶切后将其克隆到表达载体pQE30中并转化大肠埃希菌JM109,采用IPTG进行诱导表达,采用自行创新的纯化方法对表达的融合蛋白进行纯化,Western blot鉴定纯化后的重组Cap蛋白(rCap)活性.结果表明,成功克隆了无核定位信号的ORF2基因,其分子质量大小为579 bp;表达的rCap蛋白大小为24.1 ku左右,与预期大小相一致;经纯化后的rCap蛋白纯度在95%以上;Western blot鉴定结果表明,Cap蛋白可以和抗PCV-2抗体反应,具有很好的抗原性.本研究为进一步建立以Cap蛋白为包被抗原的PCV-2间接ELISA诊断方法以及PCV-2疫苗的研究奠定了基础.     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

H9N2禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定

为了实现H9N2亚型禽流感病毒的HA基因在原核系统中高效表达,试验参考GenBank发布的禽流感病毒A/chicken/Gansu/2/99(H9N2) HA基因序列(登录号为EF070733.1),优化该密码子,化学合成HA基因,并将该基因连接至pET-28a(+)质粒载体中,构建pET-28a(+)-HA重组质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后诱导表达,并优化诱导温度(16,25,30,37℃)、IPTG诱导浓度(0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mmol/L)及诱导时间(2,4,6,8,10 h),用His-tag镍柱亲和层析纯化HA蛋白,并对纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果表明:成功构建重组基因工程菌pET-28a(+)-HA/BL21(DE3),其在30℃条件下,添加IPTG终浓度为0.8 mmol/L,诱导6 h时,HA重组蛋白表达量最佳。经His-tag镍柱纯化后在预期的63 ku处出现蛋白印迹条带。说明HA蛋白在大肠杆菌中成功表达。     

鸡β干扰素的原核表达及抗病毒活性检测

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡β干扰素基因序列进行密码子优化与人工合成,构建原核表达质粒pET-28b-ChIFN-β,重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物主要以包涵体形式存在。包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化后,SDS-PAGE、Western blot分析表明pET-28b-ChIFN-β表达正确,并且表达量较高。重组鸡β干扰素蛋白在DF-1细胞上能明显抑制水疱性口炎病毒繁殖,抗病毒活性达2.73×10~6UI/mg。本研究结果为鸡β干扰素在临床防治禽类病毒性疾病的探索奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

委内瑞拉马脑炎病毒E2蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

原核表达并纯化委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)E2蛋白胞外区,并以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。利用PCR扩增VEEV E2蛋白胞外区基因并将其插入到原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达。优化诱导条件并对目的蛋白进行亲和纯化,用纯化后的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光方法检测抗体的结合能力。通过PCR扩增出约为1 023bp的VEEV E2基因胞外区,成功构建重组表达质粒pET-30a(+)-VEEV-E2,在37℃,0.6mmol/L IPTG诱导3h条件下目的蛋白表达量最高且主要以包涵体形式存在;将纯化的目的蛋白免疫BALB/C小鼠成功制备了抗VEEV E2蛋白胞外区鼠源多克隆抗体,经间接免疫荧光鉴定制备的抗体能够特异性识别真核表达的VEEV E2蛋白。VEEV E2基因胞外区在大肠杆菌中获得稳定表达,且表达的目的蛋白具有良好的免疫原性,为VEEV快速诊断方法及新型疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

熊源粪肠球菌EfaA基因的原核表达

试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列(登录号:U03756)设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

3拷贝鸡胸腺素α1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为表达鸡胸腺素α1(Thymosin alpha 1,Tα 1),并对其进行纯化及生物学活性分析,本研究根据大肠杆菌基因密码子偏嗜性对Tα 1基因进行优化,人工合成了Tα1三拷贝融合基因.并将其克隆至原核表达载体pET-30a中,转化至BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达和镍柱纯化,获得融合蛋白.融合蛋白经羟胺切...     

大肠杆菌多重耐药调控基因evgS的克隆及其原核表达

以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,根据GenBank中大肠杆菌的evgS基因序列设计引物,PCR扩增出约894 bp的基因片段,将所得片段与pMD18-T simple vector连接,转化至大肠杆菌JM109中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列测序结果与GenBank中报道一致.提取阳性克隆质粒,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实,pET-28a-evgS可成功地在大肠杆菌中表达EvgS蛋白.Western-blot检测证明,表达产物具有良好的反应原性.     

H3N2亚型犬流感病毒HA1基因的原核表达及抗原性分析

为原核表达H3N2亚型犬流感病毒(CIV)HA1蛋白,本研究利用特异性引物扩增CIV H3分离株的HA1基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。再将其亚克隆于pET-32a(+)中构建重组表达质粒pET-HA1。将该质粒转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析,表达的重组蛋白约为58 ku。纯化的HA1蛋白经western blot和Dot-ELISA鉴定表明,表达的重组HA1蛋白可以与H3N2亚型CIV阳性血清发生特异性反应。     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

猪圆环病毒2型H株cap基因原核表达载体的构建与表达

利用PCR技术从临床病料中提取病毒DNA,扩增出猪圆环病毒PCV-2核衣壳蛋白(Cap)基因。将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建了表达载体pET-H2,转化至大肠杆菌BL21中,用ITPG诱导表达。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白主要以不溶性包涵体形式表达,与预期大小30 ku相符;Western-blotting分析表明,表达产物能与抗猪PCV2阳性血清发生反应。     

禽流感病毒NA基因稀有密码子分析及其原核表达

通过原核表达获取禽流感病毒(AIV)NA蛋白,为深入研究该蛋白的抗病性奠定基础.本试验以pMD19-T-NA为模板,PCR扩增M基因完整开放阅读框(ORF),然后克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建表达质粒pET-NA;转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析检测;并利用稀有密码子在线分析软件对NA基因ORF进行分析.SDS-PAGE分析显示融合蛋白获得了表达,大小为65.4 ku;稀有密码子统计表明,NA基因ORF中稀有密码子的比例高达13.4%,甚至还有多个稀有密码子串联成簇存在.重组质粒pET-NA构建正确,且在Ecoli BL21(DE3)中成功诱导表达出目的蛋白.