番茄MYB44基因敲除载体构建研究

为探究MYB44基因在番茄生长发育中的生物学功能。本试验采用CRISPR/Cas9系统构建敲除突变体,根据MYB44基因的外显子设计sg RNA,酶切后与载体pKSE-401连接转化大肠杆菌,然后通过helper菌介导转移到农杆菌LBA4404中,形成重组菌,再应用农杆菌转化法将重组菌侵染番茄子叶外植体,经过抗生素的抗性培养基严格筛选,直至长出幼苗,最终提取DNA进行测序,获得3个独立的敲除转基因株系。     

AP70抗病基因转化番茄的研究

[目的]通过基因工程提高番茄抗病性。[方法]通过冻融法将含萝卜抗真菌蛋白基因的质粒AP70转入农杆菌LBA4404中,再用农杆菌介导法将AP70抗病基因对番茄进行遗传转化,研究预培养、侵染时间等因素对AP70转化番茄的影响。[结果]带柄子叶诱导番茄产生不定芽的效率比子叶块效率高。农杆菌浸染番茄子叶前预培养1 d,不仅能提高子叶存活率,而且可降低共培养时外植体的污染率。农杆菌对番茄子叶的侵染时间最好不超过5 min。外植体筛选培养基中Kam的浓度不宜太高或太低,可获得少量转AP70基因的抗性芽。[结论]农杆菌对番茄子叶侵染前要进行稀释,且侵染时间不宜超过5 min,共培养1 d时转化率较高。     

番茄ACC合成酶反义cDNA转化及转基因番茄果实贮藏生理特性研究

ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ被反向插入载体ＰＭＯＮ３１６，通过三亲交配，将表达质粒转移到农杆菌中，采用叶盘法转化番茄子叶。经卡那霉素筛选及分子杂交检测，表明，反义ＡＣＣ合成酶基因已在ｍＲＮＡ水平表达。对转基因番茄果实的成熟生理指标测定结果说明，转基因番茄果实成熟受到严重抑制，乙烯的峰值仅为正常番茄的２５％￣３０％，ＰＧ活性有所下降，果实在室温下可贮藏１个多月，品质和其他性状与正常番茄相近。     

农杆菌介导的番茄遗传转化体系优化研究

    研究不同的番茄基因型、培养基类型、苗龄、外植体类型、植物表达载体和选择系统等对番茄再生和遗传转化效率的影响.结果表明,7 d苗龄的子叶或13 d苗龄的下胚轴,预培养2 d,侵染20 min,培养基中添加适宜浓度的玉米素(1.0～2.0 mg·L-1)和IAA(0.1～0.2 mg·L-1),以75～100 mg·L-1的卡那霉素筛选,番茄的转化频率最高,分别为51.4%和37.5%.且以卡那霉素抗性基因为筛选标记的质粒p2301 和pBI121作为植物表达载体,其转化频率高于以潮霉素抗性基因为筛选标记的植物表达载体p1301.     

番茄子叶再生系统的初步研究

以番茄品种中蔬6号为试材,对种子表面消毒条件、子叶分化培养基及该品种对卡那霉素和头孢菌素的天然耐性进行了初步研究。结果表明:适宜的表面消毒条件为0.2％升汞2min。以子叶为外植体,适宜的分化培养基为MS+6-BA 1 mg/L+IAA 0.2 mg/L。在中蔬6号的遗传转化中,卡那霉素和头抱菌素的抑菌浓度分别以10,400 mg/L为宜。     

几丁质酶基因转化番茄的研究

以金丰一号亲本JM、JF为转化材料，建立了以子叶为外植体的离体再生体系，其芽分化培养基为MS ZT 2．0mg/L IAA0．2mg／L，生根培养基为MS。借助植物双元表达载体pROK，用农杆菌(LBA4404)与番茄子叶外植体共培养，把几丁质酶基因和抗除草剂BAR基因转化到番茄上。经过卡那霉紊和Basta的筛选和再生培养，获得转化再生植株。采用浓度为1000mg/L的Basta除草剂溶液涂抹再生植株后代叶片，表现明显抗性。对转化再生植株进行了PCR检测、Southern检测，表明上述基因已整合进番茄基因组中。     

苹果MxNas1基因转化番茄突变体‘Chloronerva’的研究

将前期构建好的含苹果属小金海棠MxNas1基因的正义表达载体pBI121-FNas转化了番茄突变体‘Chloronerva’,从不同激素配比、筛选压梯度、侵染菌液的稀释浓度、侵染时间和酚类化合物等几方面对转化条件进行了优化。结果表明,培养基激素配比ZT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L,菌液稀释10倍,农杆菌侵染5 min,卡那霉素(Kan)的选择压力浓度为50 mg/L条件下,大部分外植体还保持绿色,不定芽的分化较好,番茄子叶外植体的抗性芽生成率高达25%以上,是番茄突变体‘Chloronerva’适宜的转化条件。通过对转基因番茄的表型鉴定,转化后的不同番茄株系均能很好地互补突变体的表型,即叶脉和脉间出现了复绿现象,初步证明了MxNas1基因在植物铁代谢中的作用。     

‘蜂蜜罐’枣遗传转化条件的优化及Bt基因的导入

为建立‘蜂蜜罐’枣高效遗传转化体系,以‘蜂蜜罐’枣胚培苗上胚轴和子叶为外植体进行转化,研究了不同菌液浓度、侵染时间、共培养时间、AS(乙酰丁香酮)浓度和侵染方式对gus(β-葡糖醛酸糖苷酶)基因瞬时表达率的影响。结果表明,当菌液OD_(600)值为0.5,真空辅助侵染10 min,共培养3 d,上胚轴和子叶外植体的共培养培养基中分别添加20和10 mg·L~(-1)乙酰丁香酮时,其gus瞬时表达率均最高,为最佳遗传转化体系。利用已优化的遗传转化体系进行Bt基因转化,共获得24个PCR(聚合酶链式反应)检测呈阳性的再生芽;对PCR检测呈阳性的不定芽进行伸长培养和不定根诱导,最终获得完整转基因植株。本研究初步获得了转Bt(苏云金芽孢杆菌)基因的枣植株,为通过转基因手段进行枣抗虫新种质选育提供可能。     

植物甜蛋白基因ThaumatinⅡ转化番茄的初步鉴定

以番茄无菌苗的子叶为外植体,以抗卡那霉素的NPTⅡ作为选择标记基因,通过根癌农杆菌介导法,将甜蛋白ThaumatinⅡ基因导入番茄中,共获得10株独立的抗性转化株系。对抗性转化株系进行了PCR和Southern blotting鉴定,PCR检测得到了预期的特异条带,Southern blotting结果表明其中1个转化株系插入了2个拷贝的ThaumatinⅡcDNA。以上试验结果证明ThaumatinⅡ基因已经整合到转基因番茄植株的基因组中,为最终获得在蛋白质水平表达ThaumatinⅡ的无选择标记的转基因番茄打下了基础。     

番茄遗传转化体系的建立及LC和GFP标记基因的表达

本研究以小型番茄(miniature Lycopersicon esculentum Mill.)Micro-Tom为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定再生体系及遗传转化体系。结果表明,以子叶、下胚轴为外植体时,诱导愈伤组织和芽分化的适宜培养基均为MS 6-BA2.0mg/L IAA0.2mg/L,芽分化率均可高达92%。两种外植体适宜的生根培养基均为MS NAA0.1mg/L。同时,通过根癌农杆菌介导法,建立了Micro-Tom的遗传转化体系。而乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化番茄的效率,当AS=180μm/L时,芽分化率为52.8%;OD600=0.14是转化的最佳菌液浓度;子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生,获得了抗性苗,利用绿色荧光蛋白(GFP)检测和整株表型为紫色(Lc)基因的表达,初步证明外源基因已经整合到Micro-Tom中,为番茄激活标签体系的建立奠定了基础。     

芪合酶基因的遗传转化及其转基因烟草抗根黑腐病的研究

【目的】利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,GV3101)介导法获得转芪合酶基因烟草,改良烟草对根黑腐病的抗性。【方法】以普通烟草品种“97204”叶片为受体,采用根癌农杆菌介导法,将芪合酶基因导入烟草基因组并进行分子检测,利用灌根法对4株转芪合酶基因烟草植株接种烟草根黑腐病菌,观察烟草地上部分和根部的变化,并测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性。【结果】通过根癌农杆菌介导、抗性选择和分子检测,获得32株转芪合酶基因烟草。从中选取长势一致的4株转基因烟草用于抗病性鉴定,结果表明,2株在灌根接种后生长正常,另外2株在接种第7天时出现轻微黄化,3株根部无发病症状,另外1株在接种16 d后根部出现发黑症状,而对照植株接种后第3天叶片就出现黄化及萎蔫症状,随着接种时间的延长,叶片黄化加剧,到第7天时已出现明显的发病症状,15 d植株几乎死亡;转基因烟草PAL及PPO活性本底均显著高于对照,PAL活性在接种后4～10 d保持在一个较高的水平,10 d后又迅速下降,PPO活性在接种2 d后迅速升高,在接种6 d达到峰值,之后开始缓慢下降,而非转基因烟草PAL、PPO活性与转基因烟草相似,但变化幅度较小。【结论】用于抗性鉴定的4株转芪合酶基因烟草中,有3株对烟草根黑腐病的抗性较好。     

根癌农杆菌介导获得粳稻转基因植株

以水稻粳稻品种空育131、垦鉴稻6号、垦鉴稻7号为材料,用根癌农杆菌感染成熟胚诱导的愈伤组织,将反义蜡质基因导入受体材料。经两次抗性筛选后,转入分化培养基中分化培养后获得转基因小苗。将转化植株进行GUS染色、PCR鉴定,能证明外源目的基因已经整合到植株中。     

番木瓜美中红品种体胚转化体系的建立

利用已构建的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)基因,通过农杆菌介导法,建立美中红番木瓜(Carica papaya L.)体胚的转化体系。结果表明:共培养时,当农杆菌EHA105携带pCAMBIA2300质粒时,农杆菌的浓度(OD600 nm)应小于或等于0.1,其共培养后抑制农杆菌的羧苄青霉素浓度应以750 mg/L为宜;当农杆菌EHA105携带pBI121质粒时,则农杆菌的浓度(OD600 nm)应小于或等于0.8,其共培养后抑制农杆菌的羧苄青霉素的浓度则为500 mg/L;加上滤纸处理,抗生素洗涤以及洗涤后的干燥处理,可完全抑制体胚表面的农杆菌生长。对再生的番木瓜体胚进行PCR检测,结果表明PRSV基因已转入体胚中,但还需要成苗后的进一步检测。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转化花椰菜的研究

通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中,卡那霉素(Kan)的筛选质量浓度为15mg／L,抑制农杆菌生长的抗生素选用羧苄青霉素(carbencillin),质量浓度为500mg／L,对所获得的转基因植株进行PCR扩增,结果显示大多数为阳性;FCR-Southern及Southern分子检测分析,结果证明CpTI基因已被整合到花椰菜植株的基因组中,转基因植株叶片的离体饲虫初步试验结果表明,埘鳞翅目害虫菜青虫的生长发育育一定的抑制作用。     

根癌农杆菌介导的枇杷花药胚状体遗传转化中抗生素种类和浓度的研究

研究了安必西林、噻孢霉素和硫酸庆大霉素对根癌农杆菌EHA52的抑制效果以及对枇杷胚状体生长的影响。结果表明:安必西林、噻孢霉素浓度高于500 mg/L、硫酸庆大霉素浓度高于300 mg/L时,对农杆菌EHA52均有较好的抑制效果。但是,硫酸庆大霉素对枇杷胚状体的生长有很强的抑制效果。安必西林的浓度在800 mg/L时为最佳浓度。     

根癌农杆菌介导的人骨形成蛋白-3成熟肽基因向油菜转化的研究

用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)共培养法,将骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)基因导入甘蓝型自交系油菜(BrassicanapusL.)品种秦油-3号,并获得了hBMP-3m基因整合到油菜基因组中的植株。试验所用外植体为油菜4～5d苗龄的下胚轴;根癌农杆菌为LBA4404,其Ti质粒pCAMBIA-hBMP3m含hBMP-3m基因。切取2mm左右的下胚轴侵染根癌农杆菌后在分化培养基(MS+5.0mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)上共培养2d,然后转到附加25mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的分化培养基上。切下分化出的茎芽,插入附加25mg/L潮霉素的生根培养基(MS+0.4mg/LIBA)中,形成完整的植株。经PCR检测和Southernblot分析,证实hBMP-3m基因已插入到油菜细胞基因组中。     

苜蓿植株再生和农杆菌遗传转化条件的研究

[目的]建立苜蓿植株再生体系和农杆菌遗传转化体系。[方法]以"猎人河"苜蓿品种为受体材料,对影响苜蓿植株再生和遗传转化的相关因素进行了研究。[结果]最佳愈伤诱导培养基为改良SH+4.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA,最佳继代培养基为MSO+0.5mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L AgNO3,而最佳分化培养基为MS,苜蓿植株再生的最佳外植体是下胚轴。苜蓿农杆菌遗传转化的选择压确定为60 mg/L卡那霉素(Kan),最适宜的抗菌素为350 mg/L羧苄青霉素(Carb),农杆菌菌液的最适OD600为0.6,最佳侵染时间为10 min。[结论]该研究为今后苜蓿的基因工程研究奠定了基础。     

农杆菌介导的薹菜遗传转化体系研究

以薹菜子叶-子叶柄为外植体,研究了根癌农杆菌介导的遗传转化技术。用含GUS和NPTⅡ基因的农杆菌侵染子叶-子叶柄,获得了具有卡那霉素抗性的再生植株。再生植株经GUS组织染色,证实外源基因转化到植物基因组中。卡那霉素敏感性测定结果表明,当培养基中含卡那霉素（Km）15 mg/L时,非转化再生植株全部白化。转基因抗性芽筛选的适宜的卡那霉素浓度为10 mg/L。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究

选用在组织培养过程中能够产生分泌较多酚类物质的甘蔗基因型福农８６／１７为材料．以幼叶切段为外植体，采用叶盘法与土壤根癌农杆菌菌珠ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４：：ＰＴＤ１）菌液并培养。外植体设预培养１天、３天、５天、７天和１０天五种时间，农杆菌设稀释１０倍和２０倍两种浓度，共１０种处理组合，共培养４８小时。结果预培养５天，农杆菌稀释１０倍和２０倍两种处理组合的外植体．在含卡那霉素３００ｍｇ／Ｌ的选择诱导和选择继代培养基中诱导并形成抗性愈伤组织。