农杆菌介导的冷诱导基因水稻遗传转化体系的建立

利用农杆菌介导技术,以Bar基因为筛选标记,用高山离子芥的冷诱导基因Cbcor15a侵染水稻品种日本晴的愈伤组织,经分化诱导后获得了再生植株。经Cef和PPT筛选,共获得转化Cbcor15a基因的日本晴再生苗9株;经PCR检测和Basta涂抹实验,结果证明有6株再生苗呈阳性。本遗传转化体系的建立可为利用转Cbcor15a基因选育具有耐冷性的水稻新品种提供参考。     

农杆菌介导的冷诱导基因水稻遗传转化体系的建立

利用农杆菌介导技术,以Bar基因为筛选标记,用高山离子芥的冷诱导基因Cbcor15a侵染水稻品种日本晴的愈伤组织,经分化诱导后获得了再生植株。经Cef和PPT筛选,共获得转化Cbcor15a基因的日本晴再生苗9株;经PCR检测和Basta涂抹实验,结果证明有6株再生苗呈阳性。本遗传转化体系的建立可为利用转Cbcor15a基因选育具有耐冷性的水稻新品种提供参考。     

农杆菌介导遗传转化云蔗05-51

【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2, 4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2, 4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。     

3种抗生素对尾巨桉愈伤组织诱导及植株再生的影响

【目的】研究潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对尾巨桉愈伤组织诱导、不定芽分化及生根的影响,确立抑制农杆菌生长的头孢霉素质量浓度。【方法】以尾巨桉无菌苗茎段为外植体,先后接种于添加不同质量浓度抗生素的愈伤组织诱导培养基、不定芽诱导培养基以及生根培养基上,统计愈伤组织诱导率、不定芽诱导率和不定芽生根率,观察头孢霉素对农杆菌生长的影响。【结果】(1)培养基中的潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,200 mg/L时,尾巨桉外植体的愈伤组织诱导率分别为6.7%,12.1%和26.7%;(2)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽分化受到明显抑制,不定芽诱导率分别仅有2.6%,10.2%和7.6%;(3)潮霉素、卡那霉素、头孢霉素的质量浓度分别为15,25,250 mg/L时,不定芽生根困难,生根率分别为10.2%,16.2%和10.1%;当头孢霉素质量浓度≥200 mg/L时,农杆菌生长被完全抑制。【结论】尾巨桉对不同抗生素的敏感性存在差异,在尾巨桉遗传转化过程中,抗性愈伤组织与不定芽诱导的潮霉素适宜质量浓度为10 mg/L,卡那霉素为20 mg/L;生根诱导适宜的潮霉素和卡那霉素的质量浓度分别为15 和25 mg/L;抑制农杆菌生长的头孢霉素较适宜的质量浓度为200 mg/L。     

易感线虫番茄品种Rutgers遗传转化体系的建立

【目的】旨在建立Rutgers番茄品种的遗传转化体系。【方法】以易感线虫番茄品种Rutgers为实验材料,采用农杆菌介导法,对无菌苗的苗龄、筛选培养基中Hyg的浓度大小、不定芽诱导培养基的激素配比和生根培养基4个方面进行优化,从而建立Rutgers品种的遗传转化体系。【结果】选择9～11 d的无菌苗的叶片分化愈伤组织的效果最好,筛选培养基中Hyg的浓度为10 mg/L时可以有效的筛选转基因的抗性芽,愈伤组织诱导不定芽培养基中最佳激素配比为6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L。以1/2MS添加不同浓度IBA(0.05、0.1、0.15、0.20 mg/L)进行生根比较,再生芽在1/2 MS+IBA 0.1 mg/L生根培养基上生根最好。【结论】首次建立了Rutgers番茄品种的遗传转化体系,为番茄的抗根结线虫转基因育种打下基础。     

马铃薯‘华颂66号’遗传转化体系的建立

为探究马铃薯的最佳遗传转化体系,以紫色马铃薯‘华颂66号’无菌组培苗茎段为外植体,用农杆菌介导法将含有植物沉默载体质粒pBWA(V)KS-miR8019转化马铃薯外植体,测定不同预培养时间、不同激素组合及抗生素对马铃薯愈伤再生转化体系的影响。结果表明：1)茎段预培养时间为2 d时,愈伤组织诱导率最高;2)最适的外植体愈伤组织诱导的培养基配方为：MS干粉式培养基+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D,愈伤组织的诱导率为96.7%。最适愈伤组织分化的培养基为：MS干粉式培养基+4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L GA₃;3)植株再生及生根的抗生素最适筛选浓度为75 mg/L的卡那霉素;4)农杆菌抑制剂的最适浓度为300 mg/L的特美汀,且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入。综上,通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个影响因素进行试验,初步建立了马铃薯‘华颂66号’的遗传转化体系。     

植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本0293中的遗传转化

以超级杂交稻父本0293为材料,利用农杆菌介导基因转化法研究植物抗病基因snc1在超级杂交稻父本中的遗传转化。结果表明:0293成熟胚愈伤组织的最适诱导培养基为NMB诱导培养基,2,4–D和6–BA的最适质量浓度分别为3.0和0.2 mg/L;以LB液体培养的农杆菌转化能力最强,抽真空转化方式获得的抗性愈伤率较高,最适共培养时间为2 d;麦芽糖为抗性愈伤组织分化的最适碳源,NMB+KT 0.4 mg/L+6–BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L为较适合的分化培养基;通过优化农杆菌介导的遗传转化条件,共获得6株含目的基因snc1的转化植株。     

苜蓿植株再生及PPRV-F基因转化条件的研究

以苜蓿品种甘农1号下胚轴为外植体,研究不同培养基对苜蓿愈伤组织、体细胞胚形成的影响,通过体细胞胚发生途径建立再生体系,在此基础上,摸索农杆菌介导小反刍兽疫病毒F基因的转化条件。结果表明:所选培养基愈伤组织诱导率均为100%,UM+0.1mg/L NAA+0.5mg/L KT为诱导体细胞胚的最佳培养基。农杆菌介导的苜蓿遗传转化条件为:下胚轴预培养3d,农杆菌菌液侵染15min,然后在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养3d后清洗,选择压为卡那霉素(Km)75mg/L,抑菌浓度为头孢霉素(Cef)300mg/L。本研究为制备防治小反刍兽疫转基因植物疫苗奠定了基础。     

农杆菌介导的旱稻遗传转化主要影响因素

以旱稻品种鲲旱1号为材料,对农杆菌介导的遗传转化中愈伤组织的诱导、筛选、分化等的影响因素进行了研究。将PPA抗虫基因和bar抗性基因成功导入旱稻愈伤组织,经过筛选和分化最终获得了抗性植株。结果表明,改良的NB培养基适合于旱稻愈伤组织的诱导;当农杆菌浓度在OD600 nm为0.2~0.3,侵染时间为20 min时,转化效果最好;用40 mg/L的PPT筛选30 d后,可以获得抗性愈伤组织;将已筛选的抗性愈伤组织在预分化培养基上培养5~7 d能有效提高分化率。     

农杆菌介导的bar基因和Bt基因的遗传转化研究

[目的]探讨不同基因对不同棉花品种的遗传转化差异.[方法]以新海14号、新海16号、新海24号和新海30号四个不同基因型海岛棉胚性愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法分别将pBI121-bar/Bt和pBI121-Bt转化至四个品种中,对遗传转化体系中的PPT浓度和Cef浓度进行筛选,观察比较不同浓度下不同基因型胚性愈伤的生长状况,并对单价表达载体和双价表达载体转化不同基因型胚性愈伤的生长状态进行比较.[结果]转化体系的筛选确定双价表达载体的PPT筛选浓度为3.0 mg/L,Cef的筛选浓度为800 mg/L;转化单价表达载体LBA4404/pBI121-Bt的Cef的筛选浓度为600 mg/L.转化单价表达载体后,新海14号的出愈率最高,新海30号的出愈率最低;转化双价表达载体后,新海14号的出愈率最高,新海24号的出愈率最低.[结论]不同基因型对PPT的敏感性有差异;转化不同基因后,胚性愈伤对抗生素的敏感度有所不同;转化相同基因后,不同品种的胚性愈伤生长存在差异.     

观赏凤梨远缘杂种离体再生体系研究

[目的]建立一套观赏凤梨远缘杂种离体再生培养体系,为优质新种质的工厂化生产提供参考.[方法]以观赏凤梨V‘ Christiane’×G.dissitisflora远缘杂交种子为材料,研究不同激素组合和基因型对种子愈伤组织的诱导、芽分化和无菌苗生根的影响.[结果]在添加6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L的MS培养基上,株系Cd-40的增殖倍数最高,为20.43,其次为Cd-15、Cd-46.与MS培养基相比,在添加不同浓度NAA和6-BA的1/2MS培养基中,Cd-15愈伤组织增殖倍数为6.5~8.5.在含6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的MS培养基上,Cd-8、Cd-15、Cd-40的平均芽分化率和平均芽分化数均最高,分别为98.49%和18.4个/块.在E4培养基中,Cd-15、Cd-40的愈伤组织分化率和分化芽均达最高值.Cd-40无菌苗在含NAA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+ 6-BA 0.25 mg/L的1/2MS培养基上生根效果最好,生根率高达99.0%,平均根数为2.41条/株.[结论]在添加生长素NAA的培养基中提高6-BA的浓度有利于芽的分化,NAA是观赏凤梨无菌苗生根效果较好的激素.     

铁皮石斛组培苗生根条件优化研究

【目的】培养生根优良的铁皮石斛组培苗,提高移栽成活率。【方法】在生根培养基中添加不同激素配比（1.0~3.0 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA）进行铁皮石斛组培苗生根培养,并采取正交试验考察光照强度、pH和琼脂用量对铁皮石斛组培苗生根效果的影响。【结果】随着MS培养基中NAA浓度的升高,试管苗的鲜重和生根率呈逐渐降低的趋势,以添加NAA 1. 0 mg/L（处理1）和NAA 2. 0 mg/L（处理3）的试管苗长势最好。极差分析和方差分析结果表明,在3个培养条件中,对试管苗生根的影响大小表现为光照强度>琼脂用量>pH值,生根培养基3因素最优水平组合为光照强度2000 lx,pH 5.5,琼脂用量8.0 g/L。【结论】铁皮石斛试管苗适宜的生根培养基为1/2MS + 10%香蕉泥 + NAA 1.0 mg/L + 2%蔗糖 + 0.05%活性炭,适宜的生根条件为光照强度2000 lx、琼脂用量8.0 g/L、pH 5.5。     

银白杨遗传转化中抗生素浓度优化的研究

该文探讨了卡那霉素、G418、羧苄青霉素和头孢霉素4种抗生素对银白杨不同培养阶段外植体生长、分化或生根的影响,确立了由农杆菌介导的银白杨遗传转化研究中抗生素种类和转化体的筛选浓度.结果表明:在叶片转化筛选阶段,卡那霉素和G418的适宜浓度分别为15和10 mg/L,羧苄青霉素和头孢霉素的适宜浓度为200～600 mg/L和200～400 mg/L;在抗性芽生根培养时,卡那霉素和G418浓度分别为20～25 mg/L和15～20 mg/L,羧苄青霉素和头孢霉素浓度为200～800 mg/L和200～600 mg/L.头孢霉素或羧苄青霉素的抑菌效果因农杆菌菌株的不同而存在差异,羧苄青霉素对农杆菌LBA4404抑制效果好,头孢霉素对农杆菌C58抑制效果理想.      

羊踯躅嫩叶离体培养和植株高效再生技术研究

【目的】建立羊踯躅嫩叶离体培养及植株高效再生体系。【方法】以羊踯躅新生嫩叶为外植体,筛选嫩叶愈伤组织诱导、再分化及生根培养基,并以再生植株茎节为试材,建立高效植株再生体系。【结果】最适合羊踯躅嫩叶愈伤组织诱导的培养基为1/2 DR+2.40 mg/L 2ip+0.80 mg/L NAA,诱导率为99.5%;愈伤组织再分化的最佳培养基为1/2 DR+2.90 mg/L 2ip+0.01 mg/L NAA+1.75 mg/L KT,分化率为99.7%;适宜生根的培养基为1/4 DR+0.06 mg/L ZT+0.02 mg/L NAA,生根率达99.0%。利用再生植株茎节的快繁结果表明,在28 d的培养周期内,每节段平均增殖达5倍以上。【结论】成功建立了羊踯躅嫩叶愈伤组织诱导、再分化芽苗和植株高效再生体系,可以满足羊踯躅工厂化育苗的需要。     

不同培养基对铁皮石斛组培快繁的影响

【目的】探讨铁皮石斛种子萌发、芽增殖和生根的适宜培养基,为铁皮石斛组织快繁技术提供依据。【方法】以铁皮石斛种子为外植体进行培养,研究6-BA (0-3.0 mg/L)、NAA(0.1-0.3 mg/L)、香蕉泥(15%～25%)和马铃薯泥(15%～25%)对铁皮石斛种子萌发、芽增殖和生根壮苗的影响。【结果】适宜种子萌发的较好培养基为MS+20%马铃薯泥,芽增殖最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA,增殖率达282.7%;最适生根培养基为MS+15%香蕉泥,生根率达100%。【结论】经马铃薯泥、香蕉泥培养的铁皮石斛组培苗,生长健壮,能为生产提供大量的种苗,因而此类培养基可用于大规模生产铁皮石斛组培苗。     

不同抗生素对刺槐遗传转化受体系统的影响

本试验研究了卡那霉素(Kana)、头孢霉素(Cef)、氨苄青霉素(Amp)、羧苄青霉素(Carb)、红霉素(E)对刺槐形成层为外植体的遗传转化受体系统的影响。结果表明:刺槐形成层诱导愈伤时Cef对受体材料伤害最小,抑菌效果最好,浓度为200 mg/L时能完全抑制农杆菌生长;用Kana作为刺槐转基因植株的筛选,刺槐形成层愈伤组织分化时选择剂浓度为100~125 mg/L最佳,生根培养时选择剂浓度为75 mg/L最佳。     

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。     

根癌农杆菌介导CYP1A1转化菠萝的研究

将菠萝(Ananas comosus)愈伤组织经含有植物表达重组质粒(pUHA1-CYP1A1)的根癌农杆菌(LBA4404菌株)侵染后,在MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+100μmol/LAS+8g/Lagar上共培养3d,转入选择培养基(MS+3.0mg/LBA+2.0mg/LNAA+20mg/LKm+400mg/LCarb+8g/Lagar)上培养约10d后开始分化出不定芽;28d后将绿色的抗Km不定芽转入MS+2.0mg/LNAA+30mg/LKm+300mg/LCarb+8g/Lagar上再进行连续2轮选择,随后将绿芽转入MS+1.0mg/LIBA+30mg/LKm+8g/Lagar上生根,共获得95株Km抗性植株,转化率0.12%～2.69%.对其中部分的抗Km植株进行PCR检测,PCR阳性植株率达64.29%.经Southern杂交进一步证实,CYP1A1已整合到菠萝基因中.以琼脂为培养基凝固剂、共培养基中添加AS、增加选择次数和逐渐增加新一轮选择培养基中的Km质量浓度等是根癌农杆菌介导菠萝愈伤组织获得转基因植株的重要条件.     

白背三七组织培养技术

【目的】探讨不同激素配比对白背三七离体繁殖的影响,建立白背三七种苗再生繁殖体系。【方法】以当年生枝条为外植体,采用不同激素组合（0～0.1 mg/L 6-BA、0～0.2 mg/L KT、0～0.2 mg/L 2,4-D以及0～0.4 mg/L IBA、0～0.4 mg/L NAA）对带芽茎段进行不定芽诱导和增殖、壮苗和生根培养。【结果】在添加相同KT、2,4-D条件下,添加过高的6-BA（1.0 mg/L）会降低丛生芽增殖系数;而在相同6-BA、KT的条件下,添加2,4-D可提高芽的增殖,以在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT+0.2 mg/L 2,4-D中茎段丛芽增殖系数最高,为15.4,丛生苗较壮、生长良好。不同IBA、NAA组合均可诱导丛生芽生根,但以培养基MS+0.2 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA的生根效果最好,接种10 d开始生根,15 d时生根率为85.3%,每株平均生根数为4~9条,移栽成活率可达82.3%。【结论】建立了白背三七种苗再生繁殖体系,可为白背三七的产业化生产提供技术支撑。