黄颡鱼bmp2a与bmp4基因启动子的克隆及分析

为研究黄颡鱼bmp2a与bmp4基因的功能及其相关转录因子的调控网络,采用RLM-5′RACE方法确定bmp2a与bmp4基因的转录起始位点,通过hiTAIL-PCR方法克隆bmp2a与bmp4基因启动子序列并运用生物信息学方法预测启动子序列上的关键转录因子结合位点。结果显示,bmp2a与bmp4基因的转录起始位点分别位于bmp2a与bmp4基因编码区上游的391bp与351bp处。克隆bmp2a与bmp4的1 830bp、1 962bp启动子序列,在启动子序列的基础上预测出AP1、SP1、E-box、GATA1、CREB、PPARγ、SOX5、SOX6和SOX9等转录因子的结合位点,提示这些转录因子对bmp2a与bmp4基因的转录调控发挥潜在的重要作用。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

Lenzites gibbosa锰过氧化物酶1基因启动子序列的克隆

根据已克隆到的Lenzites gibbosa锰过氧化物酶1cDNA全长基因Lg-mnp1,在5’端设计了3个巢式特异性引物,利用染色体步移技术克隆得到了其上游1 568 bp的启动子序列。采用Signal Scan进行了启动子序列分析。结果表明,在起始密码子上游-92～-43 bp区域为Lg-mnp1启动子的基础启动子区;在-52 bp处有一个转录起始位点,-83 bp处有1个TATAAA-box,-119、-196 bp有2个反向CCAAT-box(ATTGG)。启动子区也存在多个顺式作用元件,包括转录因子SP-1(GGGCGG)、转录因子AP-2(CCCMNSSS)、热激元件HSE(NTTCNNGAAN)及6个推定的金属响应元件MRE(TGCRCNC)等。     

水稻病程相关蛋白基因OsPR-4b启动子的克隆及缺失体构建

用一对根据已克隆的水稻OsPR-4b基因序列和水稻基因组序列数据库相应序列设计的引物扩增到OsPR-4b基因上游2257 bp的启动子序列.用PLACE软件分析顺式作用元件,发现OsPR-4b基因起始密码子上游1.5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关顺式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1结合序列、Dof结合序列和MybSt1元件等.将OsPR-4b基因启动子区域及其5'部分缺失构件与gus报道基因相连,并克隆进pCAMBIA1391z载体中,用于分析启动子活性以及顺式作用元件在调控OsPR-4b基因表达中的功能.     

小鼠ISG15基因5′调控区序列的克隆及序列分析

采用LA-PCR技术扩增小鼠ISG15基因1194bp的5′调控区序列,构建了重组克隆载体pEGFP-N1-ISG15,对阳性克隆进行了PCR扩增、限制性酶切鉴定、DNA测序及生物信息学分析。结果表明:试验成功构建了包含小鼠ISG15基因5′调控区的重组质粒;经同源性比对发现ISG15基因5′调控区在不同物种中同源性不高,在转录起始位点近端的启动子区域中小鼠与人、牛、乌鳢的同源性分别为41.36%,37.89%,38.71%;经过预测该调控区富含GAS、GR、SP1、NF-1、CBF-B等转录因子结合位点,有五处Enhancer区、一处ISRE元件以及一处保守的NF-κB结合位点。本研究为进一步确定小鼠ISG15基因核心启动子区域及该基因的表达调控奠定了理论基础。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含“GC“碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

斜纹夜蛾气味结合蛋白基因GOBP2转录调控区的克隆及活性分析

[目的]本文旨在鉴定重要农业害虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)气味结合蛋白基因GOBP2的顺式作用元件,为揭示GOBP2的转录调控机制和开发基于嗅觉干扰的害虫防治技术奠定基础。[方法]利用5′RACE技术克隆GOBP2的5′UTR,确定转录起始位点;利用染色体步移技术(chromosome walking)克隆GOBP2的5′侧翼区,并利用在线网站预测转录因子结合位点;利用PCR克隆GOBP2的5′侧翼区逐步缺失片段,并构建到pGL3-Basic载体上;将各重组载体分别转染Sf9细胞,48 h后收获细胞并利用双荧光素酶报告系统检测转录活性。[结果]获得斜纹夜蛾GOBP2长23 bp的5′UTR,由此确定GOBP2的转录起始位点。通过染色体步移获得斜纹夜蛾GOBP2的5′端调控区2 025 bp的序列,发现启动子的典型TATA框;针对-1 000 bp序列的转录活性分析表明,最强转录活性区域位于-243～-207 bp,具有1个增强子;此外,在-971～-891 bp及-890～-811 bp各有1个增强子,在-244～-315 bp存在1个沉默子。[结论]获得斜纹夜蛾GOBP2的转录起始位点及顺式作用元件,为进一步研究GOBP2的转录调控机制奠定了基础。     

三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因5′侧翼序列的克隆与分析

根据三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)5′端序列设计特异引物,采用反向PCR技术从三角叶滨藜总DNA中扩增并克隆了该基因的5′侧翼区约855bp的片段。距起始密码子ATG77bp处的T碱基为可能的转录起始位点。在-25～-30bp、-260～-265bp、-337～-342bp以及-715～-720bp含有推测的TATA box(TATAAA),在-389～-393bp和-720～-724bp含有推测的CAAT box(CCAAT),以及在-112～-116bp和-397～-401bp含有推测的ABA作用元件CACGT。仅其-178～-1bp区与中亚滨藜BADH基因启动子区高度同源,同源性为90%。该BADH基因5′侧翼区与其它植物BADH基因的启动子区无同源性。     

利用5'LongSAGE标签分析蜜蜂肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2选择性转录起始位点

使用西方蜜蜂雄蜂头部5’LongSAGE文库中的肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2的标签序列,在蜜蜂全基因组序列上定位了该基因的转录起始位点(TSS),并进而预测了其启动子的结构。结果显示:蜜蜂MLC-2基因存在17个TSS,其中16个定位于MLC-2基因开放阅读框上游100bp的范围内。MLC-2基因的各TSS的使用效率不同,其中有3个优势TSS,由之起始的转录本分别占该基因总转录本数量的9.76%、54.47%和11.38%。从碱基组成来看,蜜蜂MLC-2基因TSS的第1个碱基为A、G、T、C的概率分别为58.8%、29.4%、0和11.8%。MLC-2基因的启动子结构预测结果表明,在TSS上游的300bp区域内有3个核心启动子元件。研究结果对研究蜜蜂MLC-2基因的表达调控与确定其全长cDNA序列具有重要意义。     

橡胶树HbMVK启动子的克隆与缺失表达分析

为了研究橡胶MVK基因启动子精细结构及功能,笔者利用PCR技术对橡胶树HbMVK基因启动子进行了克隆,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该启动子序列全长1 696 bp,包含CAAT-box,TATAbox,CAT-box,LTR,GARE-motif,TCA-element等元件。此外,根据元件分布,构建橡胶树HbMVK基因启动子系列缺失和全长序列表达载体并转化拟南芥。T2代转基因拟南芥中,报告基因GUS组织化学染色结果表明:HbMVK启动子全长序列和5'端-1 386 bp缺失,HbMVK启动子驱动的GUS基因只在转基因拟南芥实生苗胚轴中有极微弱表达。5'端-1 221 bp和-725 bp缺失,HbMVK启动子驱动GUS基因表达的活性较强,而5'端-325bp缺失,HbMVK启动子则完全失去活性,这表明启动子核心调控元件位于-725 bp到-325 bp之间。     

苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用Plant CARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和In Del分布情况,共发现24个SNP位点和1个In Del,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。     

番茄Mi-1基因调控元件及同源基因进化分析

为阐明Mi-1基因转录调控元件及同源基因进化特点,从番茄品种京番308中克隆Mi-1基因起始密码子上游序列,选取转录起始位点上游1 432 bp的序列进行启动子顺式调控元件分析,分析结果表明,Mi-1启动子除了含有核心元件外,还含有光响应元件、脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、低温响应元件、防御与胁迫响应元件等。Mi-1同源基因进化分析结果表明,Mi-1同源基因既包括旁系同源基因,也包括直系同源基因。当同源指数为0.70时,番茄、马铃薯、辣椒中含有Mi-1同源基因,与辣椒相比,番茄与马铃薯的亲缘关系更近。结果可为进一步研究Mi-1基因的调控表达和进化规律奠定基础。     

牛Meg8基因5'末端的克隆及生物信息学分析

利用RACE方法从奶牛中克隆得到了Meg8基因的5 '端cDNA序列(GenBank登录号:HQ407410～HQ407413),序列比对发现该基因存在4种可变剪接体.选取牛Meg8基因的5'侧翼区作为研究对象,生物信息学在线分析发现:在人、绵羊、鼠、猪、狗和马这几个物种中,牛Meg8基因5'侧翼区与绵羊相似性最高,为80.45%;该区域内存在2个SINEs、1个Simple repeat,未发现CpG岛;可能存在2个启动子位点,位于牛Meg8基因的Exon1前3 402～4 118 bp和1 200～1 367 bp处,并富含Sp1、SRY、CdxA、GATA-1、MZF1等多个潜在的转录因子位点.Meg8基因5'侧翼区密集存在的转录因子可能与基因的转录起始有关.可变剪接体及侧翼区域的诸多转录因子可能是Meg8基因行使调控功能的原因,本研究结果将为阐明该基因的功能及其调控机理提供分子基础.     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066bp的5'调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39%,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植株GUS染色发现转基因植株呈现蓝色,表明HbFPS的5'调控序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子的活性。     

玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

大豆天冬氨酸蛋白酶基因启动子的克隆及其表达活性分析

【目的】克隆大豆天冬氨酸蛋白酶基因(soyAP1)启动子,并对其表达方式及活性进行分析。【方法】利用TAIL-PCR方法从大豆基因组DNA中克隆soyAP1基因启动子片段。利用启动子在线预测工具分析soyAP1基因启动子片段的启动子元件,并用克隆得到的SAP片段替换pCAMBIA1301中的CaMV35S启动子,构建表达载体pCAM-SAP。通过农杆菌介导法,使其在大豆各组织中进行瞬时表达,用GUS组织化学染色法分析SAP在各组织中的表达活性。【结果】克隆获得了大豆soyAP1基因的启动子片段,长1 650bp,并将之命名为SAP,其转录起始位点可能是553bp处的A;PLACE分析表明,SAP序列中含有多种典型的种子特异性表达元件;GUS组织化学染色显示,SAP驱动的GUS基因在大豆根、茎、叶中基本不表达,但在种子中有较高的表达活性,且表达强度与CaMV35S启动子相近。【结论】大豆SAP启动子可能具有种子特异表达特性。     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。     

小鼠MCK基因启动子的克隆及其活性初步分析

本研究克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区以及核心启动子区,并分析和研究了其调控活性。首先以小鼠尾部肌肉基因组DNA为模版克隆了小鼠MCK基因5'侧翼区序列,回收纯化,连接pEASY-T3 Cloning载体,测序,分析了其增强子与核心启动子序列。然后将核心启动子序列亚克隆到无启动子的荧光蛋白报告载体pGL3-Venus中,转染小鼠成肌细胞C2C12,观察其在荧光显微镜下的表达情况。结果表明,小鼠MCK基因-1354～+1 bp核心启动子序列能调控Venus荧光蛋白在C2C12细胞内表达,证实MCK启动子核心序列具有组织特异性调控能力。     

香蕉凝集素基因启动子5′远端的分离分析及鉴定

在已知香蕉果实特异表达凝集素(BanLec)启动子670 bp序列的基础上,利用染色体步移方法,克隆获得该段序列5′端上游远端序列330 bp,从而得到该启动子1 000 bp序列。通过Promoter predictions、Plant CARE软件分析表明,新获得的BanLec启动子5′端330 bp序列中具有更多组织特异性表达调控元件。构建总长度为1 000 bp的BanLec启动子表达载体,以35 S启动子和原有670 bp长度BanLec启动子表达载体为对照,利用基因枪转化香蕉根、叶和果实,测量GUS基因和GFP基因瞬时表达,结果证明长度为1 000 bp BanLec启动子为果实特异表达启动子,启动活性高于原有的670 bp BanLec启动子和35S启动子。