文心兰生物钟相关基因 PRR7 克隆与表达分析

利用转录组文库中的 PRR7 基因序列,从文心兰盛开期花瓣中扩增得到文心兰 PRR7 基因的 2 个成员,分别命名为 OnPRR7-1（GenBank 登录号：MG543993）和 OnPRR7-2（GenBank 登录号：MG543994）。OnPRR7-1和 OnPRR7-2 基因全长分别为 2 091 bp 和 2 154 bp,分别编码 696 和 717 个氨基酸大小的蛋白质序列。蛋白质二级结构分析表明,OnPRR7-1 和 OnPRR7-2 均为疏水性蛋白。BlastX 比对和系统发育分析表明,OnPRR7-1 和OnPRR7-2 基因和铁皮石斛和小兰屿蝴蝶兰的 PRR 基因同源性比较高。实时荧光定量 PCR 分析结果表明,OnPRR7-1和 OnPRR7-2 基因均呈现昼夜节律性表达格式,并且在正午 12 点时表达量达到峰值;在花发育和衰老过程中,OnPRR7-1 和 OnPRR7-2 基因在花瓣中的表达量均在绽口期和衰老初期达到峰值,表明其有可能在花发育的开花和花衰老的过程中发挥作用。     

橡胶树HbMVK启动子的克隆与缺失表达分析

为了研究橡胶MVK基因启动子精细结构及功能,笔者利用PCR技术对橡胶树HbMVK基因启动子进行了克隆,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该启动子序列全长1 696 bp,包含CAAT-box,TATAbox,CAT-box,LTR,GARE-motif,TCA-element等元件。此外,根据元件分布,构建橡胶树HbMVK基因启动子系列缺失和全长序列表达载体并转化拟南芥。T2代转基因拟南芥中,报告基因GUS组织化学染色结果表明:HbMVK启动子全长序列和5'端-1 386 bp缺失,HbMVK启动子驱动的GUS基因只在转基因拟南芥实生苗胚轴中有极微弱表达。5'端-1 221 bp和-725 bp缺失,HbMVK启动子驱动GUS基因表达的活性较强,而5'端-325bp缺失,HbMVK启动子则完全失去活性,这表明启动子核心调控元件位于-725 bp到-325 bp之间。     

在文心兰不同开花阶段施用保鲜剂对切花衰老的影响

为了了解保鲜剂对不同开花阶段文心兰鲜切花的保鲜效果,利用乙烯作用剂硫代硫酸银(silver thiosulfate,STS)、1-甲基环丙烯或聪明鲜(1-methylcyclopropene,1-MCP)及乙烯释放剂乙烯利对不同开放阶段的鲜切花进行处理。结果表明:乙烯利处理在半开放期后可明显缩短文心兰切花的衰老进程,STS处理可延长盛开前期和盛开期的时间,而1-MCP处理可延长衰老初期和衰老期的时间。同时,对文心兰开花各个阶段乙烯释放和1-氨基环丙烷1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)含量进行了测定,结果显示,蕊柱和花萼中ACC含量在绽口期和半开放期基本稳定,而半开放期之后开始增加,而乙烯释放量在盛开前期后上升。花瓣ACC含量在盛开前期后缓慢增加,在衰老初期达到峰值。表明文心兰花器官内源乙烯生物合成的启动对保鲜剂不同阶段的处理效果有一定的影响和相关性。     

文心兰OnRR10基因的克隆及表达分析

为了鉴定控制文心兰花瓣衰老的关键基因，从文心兰花瓣中提取总RNA，利用RACE技术，得到OnRR10基因（登录号:MN337795）。该基因全长630 bp，编码209个氨基酸大小的蛋白质。蛋白质二级结构分析表明，OnRR10蛋白为亲水性蛋白，定位于细胞核中。同源序列比对及系统进化分析显示，OnRR10基因属于YesN家族。兰科中，OnRR10蛋白与小兰屿蝴蝶兰OnRR10亲缘关系最近。实时荧光定量分析表明，OnRR10基因在文心兰花发育的A时期（花苞期）和F时期（衰老早期）表达量达到最高值；基因表达似不受生物钟控制；细胞分裂素处理后表达分析表明，短时间内受6-BA刺激基因表达量急速上升。结果表明，OnRR10基因可能通过细胞分裂素作用而参与文心兰花瓣衰老过程。     

橡胶树HbHMGS1启动子对光照、干旱及热击处理的表达响应

克隆了橡胶树HbHMGS1基因上游长1 656 bp的启动子序列及其一系列5′缺失片段,并利用PlantCARE启动子预测软件对其进行分析,同时,以GUS基因作为报告基因,构建植物缺失表达载体并通过农杆菌介导的方法转化烟草和拟南芥,并对GUS蛋白的表达活性进行定性及定量检测分析。结果表明:该启动子能够在烟草叶片和T2代转基因拟南芥植株幼苗时期及成熟期不同组织器官中驱动下游GUS基因的表达,且叶片染色呈现明显的蓝色。将包含有HbHMGS1启动子的转基因拟南芥苗进行光周期处理发现,GUS蛋白活性在光照96 h处理时瞬间增大到处理72 h时的3.2倍,黑暗条件下处理72,96 h后叶片GUS活性也显著增加,分别是处理48 h时GUS活性的1.38和2.13倍。通过定量检测HbHMGS1启动子及其各缺失启动子响应热击及干旱处理的GUS蛋白活性发现,-699到起始密码子-1处的699 bp序列可能是主要的热击响应区域;干旱响应区域则主要位于-213到起始密码子-1处的213 bp序列中。结果表明,HbHMGS1启动子在调控HbHMGS1基因响应光照、热击及干旱诱导表达方面起到重要作用。