水稻OsTFL2基因启动子的克隆及功能验证

[目的]克隆水稻TFL2(OsTFL2)启动子序列,并分析其结构和功能,为深入研究OsTFL2基因对水稻开花和花发育的调控机理提供理论参考.[方法]采用同源克隆方法克隆OsTFL2基因启动子序列,利用PLACE和PlantCARE分析其结构和功能,并将其连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的pCAMBIA1301载体以构建pCAMBIA1301-Pro-moter植物表达载体,通过农杆菌介导转化水稻品种农垦58愈伤组织,通过对转基因植株进行GUS组织化学染色以分析该基因启动子的表达特性和调控功能.[结果]克隆获得的OsTFL2基因起始密码子上游启动子序列1.8 kb,该序列除含有真核生物典型启动子元件TATA-box和CAAT-box外,还含有花粉特异识别的顺式作用元件Pollen1lelat52(AGAAA)、开花基因转录相关的多功能转录因子CACTFTPPCA1(PACT,Y=C/T)、CCAAT box1(CCAAT)、DOFCORE(AAAG)和GATA box(GATA)、分生组织特异性元件CCGTCC-box及多个光诱导元件或光诱导相关元件如G-box、Box I、CATT-motif、GATA-motif和GT1-motif等,推测OsTFL2基因通过上述作用元件参与调控水稻花发育及开花.通过PCR检测共筛选获得16株阳性转基因植株,对其进行GUS组织化学染色,结果发现水稻的外颖、花、花药、柱头和子房中均可检测到明显的GUS色斑,而在叶片、茎尖和根尖无明显的GUS色斑,说明OsTFL2启动子能驱动GUS基因在水稻外颖、花药和子房中表达.[结论]OsTFL2基因启动子具有启动活性和组织表达特异性,可在一定程度上影响OsTFL2基因表达,对水稻花生长发育和开花发挥重要调控作用.     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

萝卜抽薹开花促进因子RsFPF1基因克隆与功能分析

采用电子克隆与基因组步移策略分离出萝卜RsFPF1基因gDNA和cDNA及启动子序列,并进行表达特征分析及转基因功能验证。序列分析表明,RsFPF1基因长度为330 bp,编码109个氨基酸;蛋白同源分析表明,RsFPF1蛋白与拟南芥及白芥FPF1蛋白间亲缘关系最近。RsFPF1基因5'上游启动子区序列长度为1 845 bp,采用PLACE和PlantCARE软件分析表明,该启动子序列含有典型调控元件及多个光响应顺式元件。半定量RT-PCR表达分析表明,开花前RsFPF1基因在茎尖表达量最高,开花后在花及花蕾中表达量最高。通过农杆菌介导的遗传转化获得转RsFPF1基因的烟草阳性植株,与野生型相比,转入RsFPF1基因的植株出现花期提前现象。结论:RsFPF1基因能够促进萝卜提早开花,其表达可能受光调控,在调控萝卜抽薹开花及花发生相关基因表达方面发挥着重要作用。     

甘蓝型油菜启动子pBnaC05g31880D的克隆与功能分析

以甘蓝型油菜冬性品种中双11的基因组为模板,克隆了BnaC05g31880D基因起始密码子上游-1 525 bp的启动子序列。顺式调控元件的预测分析表明,该启动子含有真核生物启动子必需的核心调控元件TATA box和CAAT box,同时还存在较多的其他功能元件,如光信号响应调控元件ATCT-motif、Box 4、ACE、I-box、LAMP-element、TCT-motif,厌氧感应必需的顺式作用元件ARE,茉莉酸甲酯响应顺式作用元件CGTCA-motif和TGACG-motif,玉米醇溶蛋白代谢调控元件O_2-site,赤霉素响应元件P-box等。为了验证该启动子的表达模式,构建了由其驱动GUS报告基因的植物融合表达载体DX2181G-pBnaC05g31880D,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥(Col-0)。对筛选和鉴定的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色,结果表明,GUS活性在拟南芥的各个组织中均有较强表达水平,这表明pBnaC05g31880D具有驱动GUS报告基因在拟南芥各个组织中组成型表达的特性。这为该启动子在油菜转基因提高作物品质和人工创建种质资源等方面的应用提供了较好的基础。     

橡胶树HbMVK启动子的克隆与缺失表达分析

为了研究橡胶MVK基因启动子精细结构及功能,笔者利用PCR技术对橡胶树HbMVK基因启动子进行了克隆,并对其进行了生物信息学分析。结果表明,该启动子序列全长1 696 bp,包含CAAT-box,TATAbox,CAT-box,LTR,GARE-motif,TCA-element等元件。此外,根据元件分布,构建橡胶树HbMVK基因启动子系列缺失和全长序列表达载体并转化拟南芥。T2代转基因拟南芥中,报告基因GUS组织化学染色结果表明:HbMVK启动子全长序列和5'端-1 386 bp缺失,HbMVK启动子驱动的GUS基因只在转基因拟南芥实生苗胚轴中有极微弱表达。5'端-1 221 bp和-725 bp缺失,HbMVK启动子驱动GUS基因表达的活性较强,而5'端-325bp缺失,HbMVK启动子则完全失去活性,这表明启动子核心调控元件位于-725 bp到-325 bp之间。     

甘蓝型油菜ALS基因启动子克隆及其瞬时表达分析

为研究油菜ASL基因(BnALS)启动子的功能,根据油菜基因组信息,提取得到BnASL基因上游区域的碱基序列,通过设计特异性引物对,利用PCR扩增克隆得到大小为1 048个碱基的片段。序列分析结果显示,该序列富含TATA box和CAAT box等启动子核心调控序列,并有多个与逆境、激素、光响应等表达相关的顺式作用元件,如MBS元件、ABRE元件、HSE元件CGTCA-motif、TGA-motif等。为了进一步研究其启动子功能,将其与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因融合,构建了植物表达载体p1304-P,通过根癌农杆菌介导法转化烟草(Nicotiana benthamiana),对PCR阳性的再生烟草苗进行GUS组化分析,检测GUS基因在转基因烟草中的瞬时表达情况。结果表明,克隆的BnASL基因上游序列能够驱动GUS基因在烟草根、茎、叶等组织中的表达,推测油菜ALS基因上游的1 048 bp片段具有组成型表达的启动子功能。     

水稻胚特异表达基因Os08PTS启动子的克隆及分析

为分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良。依据T-DNA插入位点信息,克隆Os08PTS基因启动子,并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征,同时构建启动子与GUS融合表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,验证启动子的表达特征。结果表明:Os08PTS基因启动子片段中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,以及光调控元件、赤霉素应答元件、生长素反应元件、参与防御和应激反应相关元件等多个与生长发育或者逆境胁迫相关的顺式作用元件,还含有与分生组织表达以及胚乳表达相关元件等。进一步构建Os08PTS启动子的GUS融合载体,并获得水稻遗传转化植株。Os08PTS启动子序列能够驱动Os08PTS基因在水稻茎和种子胚的表达,该启动子具有驱动下游基因转录的活性。     

刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析

[目的]研究刚毛柽柳水通道蛋白ThPIP基因启动子的克隆及其活性分析.[方法]采用染色体步移技术,克隆到刚毛柽柳ThPIP基因起始密码子上游1241bp启动子序列,并通过PLACE和HantCARE预测启动子序列中所包含的主要顺式作用元件.将该启动子替换pCAMBIA1301上的35S启动子,构建融合表达基因proThPlP∷GUS,通过基因枪瞬时转化烟草,并进行GUS组织化学染色.[结果]该启动子具有活性,能够驱动GUS基因的表达.[结论]为进一步鉴定该启动子中的顺式作用元件及相互作用的调控因子奠定基础,从而为揭示刚毛柽柳ThPIP基因的分子调控机制提供依据.     

甘蓝型油菜种子特异表达油体蛋白启动子P_(BnOA03)的克隆及功能分析

为了改良油菜种子的性状,常常需要研究种子特异表达目的基因的情况。在分析油菜油体蛋白表达模式的基础上,选择种子特异高表达的油体蛋白,根据甘蓝型油菜基因组序列设计引物,利用PCR技术从基因组中克隆到一段715bp的启动子序列。启动子顺式元件分析表明,这一克隆序列具有CAAT-box和TATA-box启动子基本元件,另外含有ABA响应元件等多种顺式元件。进一步利用GUS报告基因在拟南芥中对该启动子的功能进行鉴定,结果表明,在转基因株系的幼苗、根、茎、叶、花和种子发育前期及成熟种子中没有检测到GUS基因明显表达,在种子发育的中后期检测到GUS基因的表达逐渐增强。说明这个启动子的表达调控具有一定的种子特异性。     

橡胶树树皮HbbHLH基因三端序列的克隆及表达分析

[目的]为今后深入了解茉莉酸诱导橡胶树乳管分化的分子机理奠定基础。[方法]根据bHLH转录因子基因保守区设计引物,以橡胶树树皮RNA反转录第一链cDNA为模板,获得橡胶树树皮组织bHLH基因的EST序列,以此序列设计巢式引物,应用3′RACE技术对其三端序列进行克隆,并利用半定量RT-PCR分析该基因在茉莉酸处理后4 h、8 h、1 d、2 d、3 d的表达情况。[结果]克隆共得到1 084 bp的HbbHLH基因3端序列,序列分析发现该基因属于MYC型HLH结构域。表达分析结果显示,茉莉酸处理后,bHLH基因在8 h内表达逐渐增强,1 d、2 d时表达稳定最高,3 d时表达水平开始减弱。[结论]茉莉酸对HbbHLH基因的表达具有调控作用。     

巴西橡胶NBS—LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%～100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

不同寄主多主棒孢对橡胶树叶片组织防御酶活性的影响

以分离自4种寄主的5株多主棒孢菌株接种橡胶树叶片,均得到成功侵染。并按时间顺序测定了来自不同寄主的多主棒孢侵染橡胶树叶片后,细胞防御系统相关的4种酶活性的变化。结果表明,接种来自不同寄主的多主棒孢后,对橡胶树叶片4种防御酶活性的影响不同。其中分离自橡胶树的HCCGD01和HCCHN42两个菌株侵染后,橡胶树叶片组织4种防御酶活性变化最大,均有明显增强;来自木薯的MaCCGD02侵染橡胶树叶片后,酶活性变化次之;分离自番木瓜的CpCCYN01和黄瓜的PaCCSD04多主棒孢菌株侵染后,除PAL外,β-1,3-葡聚糖酶、POD、PPO活性变化很小。     

巴西橡胶两品系叶片RuBP羧化酶的免疫荧光定位

巴西橡胶树的 2个品系即 RRIM60 0和 IAN873的维管束鞘细胞富含叶绿体 ,但没有“Kranz”结构 .用从烟草提纯的Ru BP羧化酶制备兔抗 Ru BP羧化酶抗体 ,并以 FITC荧光素标记抗体 .采用直接免疫荧光法对典型的 C3植物水稻、C4 植物甘蔗和巴西橡胶树等进行了 Ru BP羧化酶的定位 .结果表明 :C3和 C4 植物叶切片中 Ru BP羧化酶的分布明显不同 ,C3植物的特异荧光存在于叶肉细胞 ,而 C4 植物的特异荧光绝大部分存在于维管束鞘细胞 .巴西橡胶树 IAN873和 RRIM60 0品系的叶肉细胞和维管束鞘细胞均存在 Ru BP羧化酶 .上述结果表明 ,巴西橡胶的一些品系 (如 IAN873、RRIM60 0 )可能属于C3-C4 中间型植物     

巴西橡胶NBS-LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%~100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

不同来源橡胶树炭疽病菌对保治达等4种药剂的敏感性测定

采用菌落生长速率法测定了18种橡胶炭疽病菌菌株对保治达等4种常用真菌性药剂的敏感性,结果显示,参试菌株对4种药剂均存在较高的敏感性,但存在一定的差异,表现为参试菌株对保治达的敏感性相对较高,烯唑醇次之,可杀得和施保克相对较差,表明参试的4种药剂对橡胶炭疽病菌均具有较强的抑制效果,均可在橡胶炭疽病的防治中推广应用,其中以保治达的防效最好。     

Cu离子对巴西橡胶树组织培养的影响

巴西橡胶树是重要的经济作物,微量元素Cu对巴西橡胶树组织培养成胚、生根及组培苗生根有重要影响。试验以巴西橡胶树花药为外植体,以改良MSB为基础培养基,改变其中Cu的浓度,进行试验,寻找最佳的微量元素Cu的含量。结果表明:培养基中不同铜元素的添加量,对巴西橡胶树胚状体及组培切苗的生根产生明显的促进及抑制作用。     

ABC转运蛋白与巴西橡胶树产胶代谢

ABC转运蛋白（ATPBindingCassettetransporter）是目前已知最大、功能最广泛的蛋白家族之一。大多数ABC转运蛋白都能利用水解ATP释放的能量直接转运底物。许多研究结果显示,植物ABC转运蛋白在各种代谢产物的跨膜转运中起着重要作用。橡胶的产胶代谢是一种典型的植物类异戊二烯次生代谢．是影响橡胶产量的首要因素。相关实验结果显示,ABC转运蛋白可能参与橡胶树产胶代谢。本文介绍了模式植物拟南芥中的ABC转运蛋白研究进展,并对ABC转运蛋白与橡胶树产胶代谢的关系进行讨论。     

农杆菌介导的橡胶树遗传转化影响因子

论述和分析了影响农杆菌介导橡胶树遗传转化的主要因子，包括橡胶树植物基因型、农杆菌菌株、菌液浓度、培养基附加成分等内外因子，简要概述并对其存在的问题和应用前景。     

入侵植物薇甘菊对橡胶树小苗生长和叶绿素荧光特征的影响

通过测定薇甘菊水浸液、茎叶覆盖和不同种植密度对盆栽橡胶树小苗生长和橡胶树小苗与薇甘菊叶绿素荧光特性来研究入侵植物薇甘菊对橡胶树小苗生长的影响,探讨橡胶树和薇甘菊间的化感与竞争潜能。结果表明,薇甘菊鲜样水浸液0.25 g/mL处理6个月后对橡胶树籽苗芽接小苗的茎围生长有显著促进作用,而对小苗的株高生长无显著作用。薇甘菊茎叶覆盖处理6个月后对橡胶树芽接小苗茎围增量显著高于种植薇甘菊1株处理,而与其它处理没有显著差异;在处理后3和9个月,各处理间均没有显著差异。实际光化学量子产量（Yield）也反映了薇甘菊水浸液0.25 g/mL和薇甘菊覆盖处理的橡胶树小苗光合效率高。因此,在试验的时间内和条件下,薇甘菊植株对橡胶树小苗还未造成不良影响,薇甘菊水浸液和茎叶覆盖能促进橡胶小苗生长,生产上可以用作有机绿肥,但必需晒干以免造成入侵危害。