巴西橡胶NBS-LRR抗病基因类似物多样性分析

【目的】克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础。【方法】根据已知抗病基因（Resistance gene, R gene）编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物 P1/P2,采集经水杨酸（SA）处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆。【结果】序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR 两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%~100.0%。进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量。【结论】通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系。     

巴西橡胶NBS-LRR抗病基因类似物多样性分析

[目的]克隆巴西橡胶抗病基因同源序列,为巴西橡胶抗病R基因的获取奠定基础.[方法]根据已知抗病基因(Resistance gene,R gene)编码的蛋白质NBS-LRR保守结构设计一对简并引物P1/P2,采集经水杨酸(SA)处理0、12、24、48 h的巴西橡胶叶片,进行cDNA同源序列克隆.[结果]序列分析结果表明,克隆获得的RGAs经系统进化分析分为TIR-NBS-LRR和non-TIR-NBS-LRR两种类型和9个基因家族;多重比较发现,克隆获得的RGAs具有典型的NBS类抗病基因保守结构域,在与已知植物NBS类序列相似性比较中,与I2c-2基因相似性最高,为46.2%,而巴西橡胶NBS类RGAs之间氨基酸相似性为22.1%~100.0%.进一步研究发现,核苷酸非同义替换和同义替换的比率小于1,有低水平的重组,表明点突变逐步积累是导致纯化选择的主要力量.[结论]通过SA诱导作用和NBS类抗病基因结合得到的巴西橡胶NBS类RGAs具有广泛的遗传多样性,并与已知抗病基因氨基酸序列具高度相似性,这些RGAs候补序列可能与某抗病基因有密切联系.     

基于NBS-LRR类R基因保守结构域克隆瓠瓜抗病基因同源序列

【目的】分离鉴定瓠瓜Lagenaria siceraria抗病种质的抗病基因同源序列(Resistance gene analogs,RGAs),为瓠瓜功能性抗病基因的克隆及分子标记辅助育种奠定基础.【方法】根据已知核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(Nucleotide binding site and leucine rich repeat,NBS-LRR)类抗病基因保守区设计简并引物,从"大籽瓠"抗性材料基因组DNA中分离抗病基因同源序列,并利用生物信息学软件进行长度变异、保守结构域、同源比对与系统进化分析.【结果和结论】基于同源克隆策略,获得23条瓠瓜NBS抗病同源序列,命名为HNB1~HNB23,Gen Bank登录号为KJ908192~KJ908214.序列分析及同源比对结果表明,这些RGAs长度变异在242~261 nt之间,18条序列具有连续开放阅读框(Open reading frame,ORF),推导氨基酸序列具有P-loop、Kinase-2a典型NBS类R基因保守结构域;核苷酸序列相似性为41.5%~98.8%,氨基酸序列相似性为21.5%~100.0%;利用NCBI Blast同源搜索发现,与其他植物尤其是冬瓜、黄瓜、葫芦及丝瓜的已知R基因具有40%~100%相似性;氨基酸序列聚类分析将其分为5个组;同源进化分析表明,23条瓠瓜RGAs均为non-TIR-NBS-LRR类R基因,与推导氨基酸序列多重比较结果一致.     

巴西橡胶NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

[目的]探讨巴西橡胶NBS类抗病基因同源序列的克隆与序列分析。[方法]以高抗炭疽病的巴西橡胶无性系R042为材料,根据抗病基因Prf、L6、N等的P．100p和GLPL保守结构域设计简并引物,从R042扩增具有抗病基因同源序列的片段,对分离获得的抗病基因同源序列进行Blastn、氨基酸同源性分析、序列比较和系统进化分析。[结果]从巴西橡胶高抗炭疽病无性系R042基因组DNA中分离获得1个NBS类抗病基因同源序列,经Blastn比对后发现,该抗病基因同源序列与毛果杨中的一个CC—NBS—LRR抗病蛋白的mRNA的序列同源性为66％,Blastn的E值为2e-24,推测氨基酸序列与已知抗病基因的相似性在26．9％～43．2％。[结论]序列比对与系统进化分析表明,该抗病基因同源序列具有NBS类抗病基因的所有保守序列,且与Xal的亲缘关系最近。     

节瓜抗镰刀菌酸突变体NBS类RGAs序列的分离鉴定

为挖掘和利用节瓜抗病种质资源,根据已克隆植物NBS-LRR(nucleotide binding site and leucine rich repeat)类抗病基因保守区设计简并引物,从节瓜抗镰刀菌酸突变体"LT3"的基因组DNA中扩增得到250 bp目的条带,通过重组克隆及测序获得22条NBS抗病同源序列(命名为JNB1~JNB22)。利用DNAStar软件及NCBI Blastx同源搜索发现,这些抗病同源序列长度为249~250 nt,推导氨基酸序列具有P-loop、Kinase-2a典型NBS类R基因保守结构域,其中21条具连续ORF(open reading frame);核苷酸序列相似性在48.8%~99.2%,氨基酸序列相似性为18.1%~100.0%;氨基酸序列聚类分析分为6个组。Blast结果显示,节瓜RGAs(resistance gene analogs)核苷酸序列与其他植物R基因最高相似性为72%~99%,对应氨基酸序列与其他植物具有36%~100%相似性,多数序列与冬瓜R基因相似性最高;同源进化分析表明,所有节瓜RGAs序列均为non TIR-NBS-LRR类,与氨基酸序列同源比对结果一致。节瓜NBS类抗病同源序列的分离鉴定为进一步克隆功能性抗病基因及分子标记辅助抗病育种提供参考。     

小麦NBS类序列的分离与特征分析

[目的]获得小麦近等基因系TcLr24中NBS类抗病基因同源序列。[方法]利用已克隆植物抗病基因NBS序列中的保守结构＂P-loop＂和＂GLPL＂合成简并引物,以小麦近等基因系TcLr24基因组DNA为模板进行PCR扩增。[结果]得到13条具有连续ORF的抗病基因类似物序列,包括P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、GLPL抗病基因所共有的保守结构,相应推测的氨基酸序列间的相似性系数在36.1%～98.3%,同时对分离的RGAs的氨基酸序列和5个已克隆植物NBS的氨基酸序列进行聚类分析表明,与Xa1、RPS2亲缘关系较近,而与Lr21亲缘关系较远。[结论]TcLr24中NBS类RGAs可能会有与Lr21不同机制的抗病功能。     

烟草(红花大金元)NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆与分析

【目的】探索烟草NBS-LRR类基因在烤烟(红花大金元)抗病中的分子作用机制。【方法】利用生物信息学手段,参考已知植物抗病基因的NBS-LRR类保守结构域,筛选并合成简并引物,扩增烟草中的NBS-LRR类抗病基因。【结果】获得4条具有连续阅读框和NBS结构域的抗病基因同源序列(TRGAH:MN027515、MN027516、MN027517、MN027518);BLAST X分析显示,均与已知植物抗病基因的NBS区域具有高度相似性,氨基酸相似性为64%～98.89%;聚类分析结果表明,4条TRGAHs与已知植物R基因P-loop-GLPL区域氨基酸序列相似性为29%～52%,包含了non-TIR-NBS-LRR和TIR-NBS-LRR两大类抗病基因。【结论】该研究利用分子克隆技术获得烟草抗病基因同源序列,为进一步筛选和构建烟草抗病候选基因及抗病品种的选育提供科学依据。     

芝麻NBS - LRR类抗病基因同源序列的分离与分析

分离和分析芝麻抗、感茎点枯病材料的抗病基因同源序列(resistance gene analogs,RGAs),可以为芝麻抗茎点枯病相关基因的克隆奠定基础.根据已知植物抗病基因的NBS - LRR类保守结构域,合成了1对简并引物和2对特异引物,对6个抗茎点枯病芝麻品种中的抗病基因进行扩增,结果得到11条抗病基因同源序列...     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

【目的】利用同源序列法分离核桃的NBS（Nucleotide binding site）类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础。【方法】以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系;利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究。【结果】35个供试核桃优系中,有20个优系为抗炭疽病类型（R）,其相对抗性指数在0.63-0.82;有5个优系为中抗类型（M）,相对抗性指数在0.27-0.56;有10个为感病类型（S）,相对抗性指数在0.00-0.21。PCR结果显示,从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列;而在其它15个优系（5个中抗优系和10个感病优系）中未扩增到条带,表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联。BLASTN显示,所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89%-100%同源性,与其它物种NBS序列的同源性在69%以上;BLASTX显示,所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77%-99%,与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49%-66%。氨基酸序列多重比对分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多态性（Pi）明显低于非保守区,有较高保守性。系统发育分析表明,在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类;所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00-0.95,为纯化选择。氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3%-63.5%,与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0%-48.5%。【结论】核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联,NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在进化上为纯化选择。     

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

 【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列（resistance gene analogs,RGAs）,聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2 基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。     

中国野生刺葡萄抗白腐病NBS-LRR类抗病基因 同源序列的分离与鉴定

【目的】通过同源克隆法从刺葡萄‘高山2号’叶片中得到抗白腐病基因的同源片段,为筛选葡萄抗白腐病基因奠定基础。【方法】根据已知植物抗病基因NBS-LRR保守区设计简并引物,从高抗葡萄白腐病刺葡萄‘高山2号’的基因组DNA与cDNA上得到抗病基因同源片段(RGAs),并对其表达分析进行检测。【结果】从刺葡萄‘高山2号’上获得了10个NBS-LRR类抗病基因同源片段,10条葡萄RGAs间在氨基酸水平上的同源性表现出丰富的多态性,进一步分析发现,在10条葡萄RGAs中,4个推测所属基因为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,6个所属基因为TIR-NBS-LRR类抗病基因。定量PCR分析表明,NB7基因受到白腐菌的诱导,而且NB7基因在刺葡萄叶片中为低丰度表达,NBS6基因受到白腐菌的诱导后为下调表达。【结论】在刺葡萄上成功获得了抗病基因同源序列,通过荧光定量PCR分析发现,NB7基因与NBS6基因都受到白腐菌的诱导表达,为最终克隆得到葡萄抗白腐病基因奠定基础。     

棉花NBS抗病基因的发掘

根据已克隆的R基因的保守序列设计引物,在棉花不同抗性品种中克隆出500 bp左右大小片段,克隆测序并在NCBI上进行Blast分析,发现这些序列除一个序列外均与已经克隆的抗病基因类似物(RGAs)同源,且同源性高达98%以上。将这些从棉花中克隆的RGAs和植物中已克隆的几个典型的R基因序列建立进化树,棉花中的RGAs序列分别聚在3个不同的亚家族,可以通过后续的功能验证来确定这些序列片段的功能。     

柚cDNA中NBS-LRR类R基因同源序列的分离

 提取柚花柱的总RNA，通过逆转录合成其cDNA，根据已知植物抗病基因（R基因）的NBS保守区设计简并引物，对cDNA进行扩增，获得大小约为500 bp的PCR产物，对连接产物进行酶切归类，筛选得到不同类别的克隆12个，并进行了测序。通过序列同源比较分析发现，其中有10个片段属于NBS-LRR类抗病基因的同源序列（RGA），与已知植物R基因相应区段的氨基酸序列的同源性为11.5%～47.1%。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。【方法】根据已克隆植物抗病（R）基因NBS-LRR保守区段设计两对引物，采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35 的RNA进行扩增。【结果】 获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2，长度分别为239bp、289bp和539bp，编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明，PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%；S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%；经BLASTp比较，3个片段均含有NB-ARC保守结构域，与已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相应区域相一致，具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a等）。Northern杂交分析表明，3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【结论】本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列，为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析

 【目的】从橡胶树中克隆Glutathione-S-transferase（GST）基因的cDNA和基因组DNA,进行序列、结构和系统进化分析,研究胁迫条件和激素处理下的表达谱。【方法】利用产排胶机理课题组构建的胶乳EST数据库,通过PCR技术克隆橡胶树GST基因的cDNA和基因组DNA;在线预测蛋白质保守功能域和亚细胞定位,构建系统进化树,利用实时荧光定量PCR分析割胶、伤害、低温、激素和死皮病等因素对该基因表达的影响。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到1个GST基因的全长cDNA（793 bp）,编码25.4 kD（219aa）蛋白,命名为HbGSTU1;克隆了HbGSTU1的基因组DNA（1 313 bp）,包含1个内含子（520 bp）和2个外显子。HbGSTU1属于GST Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;HbGSTU1与一个蓖麻GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性为85%;HbGSTU1的表达受割胶、伤害、低温、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素调控,但对JA、SA和ABA处理的应答不明显。【结论】HbGSTU1是一个典型的GST Tau家族蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。