草原红牛FABP7基因克隆、生物信息学及组织表达差异分析

本研究旨在克隆草原红牛脂肪酸结合蛋白7基因(FABP7)的CDS区序列并对其进行生物信息学分析,同时检测其在牛各个组织中的mRNA表达水平。利用RT-PCR技术克隆草原红牛FABP7基因CDS区序列,并使用多种生物软件和在线工具进行生物信息学分析,通过qPCR技术检测FABP7基因在各组织间mRNA的表达水平。结果表明:草原红牛FABP7基因CDS区全长399 bp,编码132个氨基酸,蛋白分子量为14.96 ku,理论等电点为5.38,属于亲水性蛋白;通过NCBI-BLAST对比发现,草原红牛与普通牛、羊、猪、人、鼠、鸡的核苷酸序列同源性分别为99%、98%、94%、92%、85%、85%,系统进化树结果发现,草原红牛与普通牛亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;FABP7蛋白序列有1个二硫键,14个磷酸化位点,1个N-糖基化位点,不存在信号肽和跨膜区;在蛋白的二级结构和三级结构中发现,FABP7蛋白主要存在2个α-螺旋结构和10条β-折叠,为混合型蛋白。FABP7基因在小肠组织表达量最高,在心脏、脂肪和胃中中度表达。     

驴Zfx基因CDS序列克隆及序列分析

本研究旨在克隆驴Zfx基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的牛Zfx基因mRNA序列(登录号:D84097.1)设计特异性引物,利用RT-PCR技术获取驴Zfx基因CDS序列,并对驴Zfx基因CDS区核苷酸序列和蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfx基因CDS区序列长度为2 403 bp,编码800个氨基酸;驴与马、牛、家犬、白犀牛、马鹿、猫、人、绵羊、黑猩猩的Zfx基因CDS区核苷酸序列同源性分别为99.6%、95.0%、95.3%、97.9%、93.5%、94.9%、95.0%、95.7%和94.9%。对驴及其他9种哺乳动物Zfx基因CDS区的核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,驴与马亲缘关系很近,与白犀牛的亲缘关系次之;同时又与聚在一类的家犬、猫亲缘关系较近,而与绵羊、牛的亲缘关系稍远。Zfx蛋白理论等电点(pI)为5.19,不稳定系数为42.94,消光系数为35 810,属于不稳定的亲水性蛋白,含有60个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构,属于非分泌蛋白。Zfx蛋白α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别为23.12%、20.25%和56.63%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。本试验成功克隆获得驴Zfx基因CDS序列,为后期深入研究该基因及其编码蛋白的结构功能提供依据。     

绵羊Txl-2基因CDS区克隆及其生物信息学分析

本研究以绵羊睾丸组织为材料,利用RT-PCR技术获得绵羊硫氧还蛋白类蛋白2(Thioredoxin like protein 2,Txl-2)基因的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆得到的绵羊Txl-2基因CDS区为795 bp,编码264个氨基酸。生物信息学分析结果表明,Txl-2编码的蛋白无跨膜区、信号肽和N-糖基化位点,存在多个磷酸化位点;预测出了Txl-2蛋白的二级结构和三级结构;Clustel W方法对比绵羊Txl-2与绵羊、山羊预测序列同源性最高。     

驴Zfx基因CDS序列克隆及序列分析

本研究旨在克隆驴Zfx基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的牛Zfx基因mRNA序列（登录号：D84097.1）设计特异性引物,利用RT-PCR技术获取驴Zfx基因CDS序列,并对驴Zfx基因CDS区核苷酸序列和蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfx基因CDS区序列长度为2 403 bp,编码800个氨基酸;驴与马、牛、家犬、白犀牛、马鹿、猫、人、绵羊、黑猩猩的Zfx基因CDS区核苷酸序列同源性分别为99.6%、95.0%、95.3%、97.9%、93.5%、94.9%、95.0%、95.7%和94.9%。对驴及其他9种哺乳动物Zfx基因CDS区的核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,驴与马亲缘关系很近,与白犀牛的亲缘关系次之;同时又与聚在一类的家犬、猫亲缘关系较近,而与绵羊、牛的亲缘关系稍远。Zfx蛋白理论等电点（pI）为5.19,不稳定系数为42.94,消光系数为35 810,属于不稳定的亲水性蛋白,含有60个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构,属于非分泌蛋白。Zfx蛋白α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别为23.12%、20.25%和56.63%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。本试验成功克隆获得驴Zfx基因CDS序列,为后期深入研究该基因及其编码蛋白的结构功能提供依据。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

绵羊IGFBP-3基因的克隆及序列分析

旨在克隆IGFBP-3基因的CDS序列及其生物信息学分析,试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-3基因的CDS全序列,生物信息学方法深入分析其序列。结果表明:IGFBP-3基因的CDS序列为882bp,编码293个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为94%、83%、81%,氨基酸序列同源性分别为91%、77%、79%,GenBank登录号为FJ752574;IGFBP-3基因的氨基酸分子量为31.5KD,理论等电点(pI)为8.98;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与鸡、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-3基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有一个信号肽、25个磷酸化位点、7个N-糖基化位点和4个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为73.04%、13.99%、12.97%;三级结构分析显示存在IGFBP-N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。为进一步研究绵羊IGFBP-3基因的功能奠定基础。     

绵羊IGFBP-5基因的克隆及序列分析

为了克隆IGFBP-5基因的CDS序列及其生物信息学分析,试验以凉山半细毛羊为研究对象,采用RT-PCR方法克隆了IGFBP-5基因的CDS全序列,并用生物信息学方法深入分析其序列。结果表明:IGFBP-5基因的CDS序列为816 bp,编码271个氨基酸,与牛、人、鼠的CDS同源性分别为97%、94%、89%,氨基酸序列同源性分别为98%、98%、95%,Gen Bank登录号为EU727460.1;IGFBP-5基因的氨基酸分子质量为30.3 ku,理论等电点(p I)为8.56;进化分析显示与牛、山羊等哺乳动物关系较近,与蟾、鱼类等亲缘关系较远;IGFBP-5基因存在明显的疏水性区域和亲水性区域,有1个信号肽、22个磷酸化位点、2个N-糖基化位点和3个O-糖基化位点;二级结构分析显示无规卷曲、α-螺旋和β-折叠区域分别为66.42%、22.51%、11.07%;三级结构分析显示存在IGFBP_N和甲状腺球蛋白-Ⅰ型功能域。     

草原红牛ACSL3基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在克隆草原红牛长链酰基辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)基因编码区并对其进行生物信息学分析,同时在mRNA和蛋白质水平上分析ACSL3基因在草原红牛不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术和TA克隆的方法获得草原红牛ACSL3基因CDS序列;利用在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,分析ACSL3基因与其他物种的同源性并构建系统进化树,分析ACSL3基因编码蛋白质的基本理化性质、潜在磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、信号肽、二硫键、跨膜区结构、亚细胞定位及该基因编码蛋白的二级结构、三级结构;通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测ACSL3基因在草原红牛各组织间的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,试验成功克隆了草原红牛ACSL3基因CDS区,全长2 163 bp,编码720个氨基酸,蛋白分子质量为80.28 ku,理论等电点为8.74,属于亲水性蛋白。通过NCBI中BLAST比对发现,草原红牛与牛、绵羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡的ACSL3基因核苷酸序列同源性分别为99%、97%、93%、91%、88%、88%和78%;系统进化树结果表明,草原红牛与牛、绵羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。该蛋白序列有7个二硫键,66个磷酸化位点,9个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,不存在信号肽,但存在1个跨膜区。二级结构和三级结构分析结果表明,ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接,蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主,为混合型蛋白。mRNA和蛋白表达量检测结果显示,ACSL3基因在肾脏和肌肉组织中表达量较高,显著高于其他组织(P<0.05);在胃、肝脏和心脏中中度表达,显著高于脾脏、肺脏、肠和脂肪(P<0.05);在脾脏、肺脏、肠和脂肪中相对低表达,说明草原红牛ACSL3基因可能与体内脂肪沉积和脂质代谢等调控功能有关。本试验结果为进一步研究ACSL3基因在草原红牛中脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供了基础材料。     

固始鸡XCL1基因CDS区克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆鸡淋巴细胞趋化因子（lymphotactin,XCL1）基因CDS区并探索其生物学特性。试验以固始鸡胸腺组织总RNA为模板,采用RT-PCR技术对该基因的CDS区进行扩增和克隆,并通过生物信息学软件进行相关生物信息学分析。结果表明,固始鸡XCL1基因CDS区长294 bp,编码97个氨基酸。相似性分析结果发现,鸡XCL1基因CDS区序列与牛、山羊、绵羊、人、小鼠、猪和大鼠的相似性分别为53.7%、53.0%、52.9%、51.8%、51.1%、50.9%和50.4%。进化树结果表明,鸡作为非哺乳动物,与哺乳动物亲缘关系较远。XCL1蛋白分子式为C₄₉₁H₈₂₂N₁₅₀O₁₃₂S₆,理论等电点为10.95,属于碱性蛋白;分子质量为11.13 ku,脂肪系数为102.37,不稳定系数为51.44,属于不稳定蛋白,半衰期为30 h;具有跨膜结构（第5-27位氨基酸）和信号肽区域（第1-18位氨基酸）,属于亲水性分泌型蛋白。XCL1蛋白存在8个潜在的磷酸化修饰位点和3个潜在的糖基化修饰位点。XCL1蛋白的二级结构由α-螺旋（35.05%）、β-转角（5.15%）、延伸链（26.80%）和无规则卷曲（32.99%）组成,三级结构预测结果与二级结构一致。亚细胞定位分析表明XCL1蛋白主要在细胞外发挥作用;该蛋白有1个位于第31—88氨基酸残基处的SCY保守性结构域;该蛋白能与OXT、PTAFR、GPR132和XCR1等分子形成互作网络。本试验结果为进一步研究鸡XCL1基因功能提供理论参考。     

山羊溶酶体α-AMA基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析

本研究旨在对山羊溶酶体α-甘露糖苷酶(α-AMA)基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛α-AMA基因序列设计引物,采用PCR技术克隆山羊α-AMA基因序列,并利用荧光定量RT-PCR进行组织表达谱分析以及进行生物信息学预测。首次获得了山羊α-AMA基因,含有完整CDS编码区3 000bp,编码999个氨基酸,其中前50个氨基酸为信号肽序列。其编码区的核苷酸序列和预测氨基酸序列与牛的α-AMA相似性最高,分别为95.93%和94.79%。组织表达谱分析表明α-AMA在山羊各组织均不同程度的表达,其中在肺脏、肝脏、小脑表达量较高。生物信息学预测发现,α-AMA蛋白属于糖苷水解酶38家族成员,有2个保守的结构域,存在9个N-糖基化位点。SWISS-MODEL同源建模山羊α-AMA具有良好的可信度。本研究为探讨酶的作用机理及疯草解毒剂的研制提供了理论依据。     

草原红牛ACSL3基因CDS区克隆、生物信息学分析及组织表达研究

试验旨在克隆草原红牛长链酰基辅酶A合成酶3(long-chain acyl-CoA synthetase 3,ACSL3)基因编码区并对其进行生物信息学分析,同时在mRNA和蛋白质水平上分析ACSL3基因在草原红牛不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术和TA克隆的方法获得草原红牛ACSL3基因CDS序列;利用在线软件对ACSL3基因进行生物信息学分析,分析ACSL3基因与其他物种的同源性并构建系统进化树,分析ACSL3基因编码蛋白质的基本理化性质、潜在磷酸化位点、O-糖基化位点、N-糖基化位点、信号肽、二硫键、跨膜区结构、亚细胞定位及该基因编码蛋白的二级结构、三级结构;通过实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测ACSL3基因在草原红牛各组织间的mRNA和蛋白表达水平。结果显示,试验成功克隆了草原红牛ACSL3基因CDS区,全长2 163 bp,编码720个氨基酸,蛋白分子质量为80.28 ku,理论等电点为8.74,属于亲水性蛋白。通过NCBI中BLAST比对发现,草原红牛与牛、绵羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡的ACSL3基因核苷酸序列同源性分别为99%、97%、93%、91%、88%、88%和78%;系统进化树结果表明,草原红牛与牛、绵羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。该蛋白序列有7个二硫键,66个磷酸化位点,9个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,不存在信号肽,但存在1个跨膜区。二级结构和三级结构分析结果表明,ACSL3蛋白通过无规则卷曲连接,蛋白质结构以α-螺旋和β-转角为主,为混合型蛋白。mRNA和蛋白表达量检测结果显示,ACSL3基因在肾脏和肌肉组织中表达量较高,显著高于其他组织(P0.05);在胃、肝脏和心脏中中度表达,显著高于脾脏、肺脏、肠和脂肪(P0.05);在脾脏、肺脏、肠和脂肪中相对低表达,说明草原红牛ACSL3基因可能与体内脂肪沉积和脂质代谢等调控功能有关。本试验结果为进一步研究ACSL3基因在草原红牛中脂质代谢及脂肪沉积等方面的调控作用提供了基础材料。     

猪ASB2基因CDS区克隆、生物信息学分析及表达规律研究

本研究旨在克隆猪锚蛋白重复序列和细胞信号抑制因子盒蛋白2（ankyrin repeat and suppressor of cytokine signalling box containing protein 2,ASB2）基因完整CDS区序列,通过生物信息学方法分析CDS序列和蛋白质基本特性,探讨其在晋汾白猪不同组织及卫星细胞诱导成肌过程中的表达规律。选取1日龄晋汾白猪为研究对象,依据GenBank中猪ASB2基因预测核苷酸序列设计引物,以背最长肌组织cDNA为模板,采用分段扩增法进行猪ASB2基因的克隆。利用生物信息学软件分析ASB2氨基酸序列及编码蛋白质的结构和功能,利用实时荧光定量PCR技术检测ASB2基因在猪不同组织及卫星细胞诱导成肌过程中的表达水平。结果显示,猪ASB2基因完整CDS区序列长1 824 bp,共编码607个氨基酸。猪ASB2基因核苷酸序列与山羊和牛的相似性最高。生物信息学分析发现,ASB2蛋白为亲水性蛋白,共有54个磷酸化位点,11个O-糖基化位点,1个N-糖基化位点,没有信号肽。保守结构域分析结果表明存在11个ANK基序和1个SOCS基序。猪ASB2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链分别占43.99%、40.36%、10.05%和5.60%。实时荧光定量PCR结果显示,ASB2基因在猪腰大肌组织中表达量最高,其次为背最长肌和心脏,且与其他组织中表达量具有极显著差异（P<0.01）;在诱导卫星细胞成肌过程中发现该基因表达量呈先升高后降低趋势,提示其可能参与调控肌肉生长过程。本研究结果可为进一步探讨猪ASB2基因功能及作用机制提供参考依据。     

猪ASB2基因CDS区克隆、生物信息学分析及表达规律研究

本研究旨在克隆猪锚蛋白重复序列和细胞信号抑制因子盒蛋白2(ankyrin repeat and suppressor of cytokine signalling box containing protein 2,ASB2)基因完整CDS区序列,通过生物信息学方法分析CDS序列和蛋白质基本特性,探讨其在晋汾白猪不同组织及卫星细胞诱导成肌过程中的表达规律。选取1日龄晋汾白猪为研究对象,依据GenBank中猪ASB2基因预测核苷酸序列设计引物,以背最长肌组织cDNA为模板,采用分段扩增法进行猪ASB2基因的克隆。利用生物信息学软件分析ASB2氨基酸序列及编码蛋白质的结构和功能,利用实时荧光定量PCR技术检测ASB2基因在猪不同组织及卫星细胞诱导成肌过程中的表达水平。结果显示,猪ASB2基因完整CDS区序列长1 824 bp,共编码607个氨基酸。猪ASB2基因核苷酸序列与山羊和牛的相似性最高。生物信息学分析发现,ASB2蛋白为亲水性蛋白,共有54个磷酸化位点,11个O-糖基化位点,1个N-糖基化位点,没有信号肽。保守结构域分析结果表明存在11个ANK基序和1个SOCS基序。猪ASB2蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链分别占43.99%、40.36%、10.05%和5.60%。实时荧光定量PCR结果显示,ASB2基因在猪腰大肌组织中表达量最高,其次为背最长肌和心脏,且与其他组织中表达量具有极显著差异(P0.01);在诱导卫星细胞成肌过程中发现该基因表达量呈先升高后降低趋势,提示其可能参与调控肌肉生长过程。本研究结果可为进一步探讨猪ASB2基因功能及作用机制提供参考依据。     

延边牛PLIN2基因CDS区克隆、生物信息学分析及其表达规律研究

本研究旨在克隆延边牛脂肪分化相关蛋白PLIN2基因完整CDS区,通过生物信息学分析PLIN2基因CDS区序列和蛋白质基本特性,探讨其在延边牛不同组织及前体脂肪细胞成脂过程中的表达规律。选取18月龄去势的延边牛为研究对象,利用RT-PCR和基因克隆获得延边牛PLIN2基因,与其他物种进行同源性比对及系统进化树构建,利用生物信息学方法预测PLIN2编码蛋白质的理化性质、潜在磷酸化位点及糖基化位点、二硫键分析、信号肽、亚细胞定位、蛋白高级结构,利用实时荧光定量PCR检测PLIN2基因在延边牛不同组织中的表达水平。结果显示,延边牛PLIN2基因CDS长1 353 bp,编码450个氨基酸;同源性比对发现延边牛PLIN2基因与黄牛、水牛、绵羊、山羊、野猪、人、小鼠和野鸡的同源性分别为100%、98.7%、96.7%、97.1%、85.5%、86.3%、47.3%和49.1%;系统进化树表明,延边牛与黄牛、水牛的亲缘关系最近,与野鸡的亲缘关系最远。PLIN2蛋白为不稳定蛋白,具有一定亲水性,存在61个潜在的磷酸化位点、16个O-糖基化潜在位点、12个N-糖基化潜在位点,存在2个二硫键,不存在信号肽,主要分布于细胞核中,细胞质和线粒体中有少量分布。PLIN2蛋白高级结构预测该蛋白是由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角组成,为混合型蛋白,通过无规则卷曲连接,以α-螺旋为主。实时荧光定量PCR结果显示,PLIN2基因在延边牛小肠组织中表达量最高,其次为背最长肌和肾脏组织。本研究结果可为进一步研究PLIN2基因的功能提供借鉴。     

马身猪CD63基因CDS区的克隆、表达及生物信息学分析

为了克隆马身猪CD63基因的CDS区,检测其在不同组织中的表达规律,预测编码蛋白的结构与功能,该研究对山西省地方品种马身猪CD63基因CDS区进行扩增和克隆,采用qRT-PCR技术检测CD63基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腰大肌、背部皮下脂肪等组织中的表达规律,采用生物信息学方法分析CD63蛋白的生物学特性。结果表明,该研究成功克隆出猪CD63基因的CDS区,全长714 bp,已上传NCBI数据库,登录号为MN082631。该基因在所检测的组织中均有表达,且在不同组织中的表达量有显著差异(P0.05),脂肪组织中表达量最高,其次是肝脏、肌肉、脾脏,肾脏中的表达量最低。经生物信息学预测,该基因编码的蛋白质含237个氨基酸,属于中性稳定四跨膜蛋白,有3个可能的N-糖基化位点,其中2个位点位于第3个与第4个跨膜结构域之间的胞外区内,另一个在第1个与第2个跨膜结构域之间的胞外区内;可能存在Ser磷酸化位点6个,Thr磷酸化位点4个,Tyr磷酸化位点1个;CD63蛋白为疏水性蛋白,α-螺旋、延伸、β-折叠和无规则卷曲分别占58.23%、11.39%、5.49%和24.89%。猪CD63蛋白氨基酸序列与野骆驼的相似性最高,其次是羊驼、长江江豚和抹香鲸,同时与骆驼科的野骆驼和羊驼的遗传距离最近,符合生物进化规律。该试验成功克隆了马身猪CD63基因CDS区,并进行了生物信息学分析,为深入探讨CD63基因生物学功能提供参考。     

山羊PPARα基因克隆、分子特性及组织差异表达分析

试验旨在克隆山羊过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptors-alpha,PPARα)基因的CDS区序列,分析其编码蛋白的结构与功能,并探讨其在山羊不同组织中的表达模式。采用RTPCR方法扩增并克隆PPARα基因CDS编码区;通过在线软件对其一级结构、二级结构和三级结构进行生物信息学分析;利用基因序列和编码蛋白构建系统发育树,进行系统发育进化分析;采用实时荧光定量PCR方法检测PPARα基因在简州大耳羊心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏和网膜6个组织中的相对表达情况。结果表明,山羊PPARα基因CDS区全长1 413bp,结构稳定,共编码470个氨基酸。生物信息学分析发现,PPARα蛋白是一种结构较为稳定的带负电的亲水性蛋白,以α-螺旋和无规则卷曲为主,无信号肽和跨膜蛋白,属于膜内蛋白。蛋白序列中总共有49个磷酸化位点,9个糖基化位点。保守结构域中含有明显的DBD区域和LBD区域,蛋白结构高度保守。三级结构预测发现其蛋白结构主要为通过长链卷曲连接的2个明显不同的结构区域,结构均以helix螺旋为主。序列比对结果表明,山羊PPARα氨基酸序列与绵羊和牛的同源性最高。实时荧光定量检测结果表明,PPARα基因在肾脏和肝脏中表达量较高,显著高于其他组织(P0.05);在网膜组织和心脏中中度表达,显著高于肺脏和脾脏(P0.05);在肺脏和脾脏中相对低表达;说明山羊PPARα基因可能与体内脂肪氧化、脂质代谢和抗氧化应激等调控功能有关。试验结果为深入研究PPARα基因在山羊中的生理功能和调控机制奠定了理论基础。     

牛Ⅰ型干扰素受体α链与其配体结合活性的鉴定

为研究牛Ⅰ型干扰素受体α链(IFNAR1)与其配体结合的生物学性质,本研究采用RT-PCR方法从感染水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的犊牛原代肾细胞中扩增得到IFNAR1基因,然后构建了表达BoIFNAR1胞外区多肽(BoIFNAR1-EC)的原核表达载体pET30a-BoIFNAR1-EC,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达出重组蛋白rBoIFNAR1-EC,并以纯化后的rBoIFNAR1-EC作为免疫原制备兔抗牛IFNAR1的多克隆抗体,随后鉴定BoIFNAR1与其配体的结合活性。结果表明,试验成功克隆得到1 685bp的牛IFNAR1基因,编码560个氨基酸,由24个氨基酸组成的信号肽、414个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸组成的跨膜区及99个氨基酸组成的胞内区组成,与其他物种IFNAR1氨基酸序列同源性为63%~91%,在进化上具有高度保守性,其与羊的亲缘关系最近。随后构建了含牛IFNAR1胞外区基因的重组表达载体,并诱导表达了重组牛IFNAR1胞外区蛋白rBoIFNAR1-EC,其在大肠杆菌中几乎全部为可溶性表达,经纯化透析后作为免疫原制备了兔抗牛IFNAR1的特异性抗体,抗体效价高达1∶204 800。配体结合试验表明,牛IFNAR1重组蛋白可与牛IFN-αA和IFN-ε结合,其多克隆抗体可阻断牛IFN-αA和IFN-ε与细胞表面的IFNAR1特异性结合,进而阻断牛IFN-αA和IFN-ε的抗病毒信号传导。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

撒坝猪SPDEF基因克隆及其生物信息学分析

为明确猪SPDEF基因的遗传特性,试验对不同猪种SPDEF基因的CDS区进行序列扩增、测序、拼接,并对撒坝猪SPDEF基因CDS序列进行生物信息学分析。采用PCR直接测序法测定猪SPDEF基因外显子序列,运用SeqMan进行序列拼接。采用生物信息学软件分析撒坝猪SPDEF基因开放阅读框及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构、功能结构域,并构建系统进化树。结果表明,各猪种SPDEF基因编码区仅在外显子1、2分别检测到1个同义突变(C13971T、C16541T),表明该基因编码区在所检测的猪群中高度保守。生物信息学分析发现,该基因有1个长1 092 bp的完整开放阅读框;SPDEF蛋白中丝氨酸(Ser)含量最高(10.7%),体外理论半衰期为30 h,属于不稳定的亲水性蛋白;该蛋白不存在信号肽及跨膜结构,存在39个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,亚细胞定位于细胞质;二级结构预测中,参与无规则卷曲的氨基酸最多(55.10%),其次是α-螺旋(28.37%);功能结构域预测发现,该蛋白存在1个ETS功能结构域和1个SAM-PNT功能结构域。系统进化树结果显示,撒坝猪与牛、绵羊和山羊的亲缘关系较近。本研究为进一步分析撒坝猪SPDEF基因的功能奠定了一定的理论基础。     

白来航鸡STING基因克隆、生物信息学及组织表达特性分析

【目的】克隆白来航鸡干扰素基因刺激因子基因(stimulator of interferon genes, STING)CDS区序列并进行生物信息学和组织表达分析,为阐明STING基因在抗病毒免疫应答中的作用奠定基础。【方法】采用PCR扩增并克隆白来航鸡STING基因CDS区,测序后对其编码氨基酸序列进行相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学预测STING蛋白的理化特性及结构功能,并利用实时荧光定量PCR技术检测STING基因在鸡心脏、肝脏等14个组织中的表达情况。【结果】白来航鸡STING基因CDS区序列全长1 140 bp,编码379个氨基酸。相似性比对和系统进化树分析结果表明,白来航鸡STING基因与原鸡的相似性最高(99.7%),亲缘关系最近,与冠小嘴乌鸦亲缘关系最远。STING蛋白为酸性、亲水性蛋白,分子质量为42.625 ku,等电点(pI)为6.67,不稳定系数为69.26,脂肪系数为105.01。该蛋白大部分在线粒体和内质网上合成,含有跨膜结构,不含信号肽。STING蛋白二级结构包括α-螺旋(54.62%)、延伸链(10.29%)、β-转角(3.43%)及无规则卷曲...