绵羊MC4R基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对绵羊MC4R基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛MC4R基因序列设计引物,采用PCR技术克隆绵羊MC4R基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的绵羊MC4R基因全长1 919 bp,含有999 bp的完整CDS编码区,编码332个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与牛、人、猪、大鼠、小鼠MC4R基因对应序列的同源性分别为95.2%、68.8%、82.7%、76.6%、77.1%,预测的氨基酸序列同源性分别为97.0%、92.8%、93.7%、92.2%、91.6%。组织表达谱分析表明MC4R基因在各组织均不同程度的表达,其中在大脑表达量很高,其他组织较低。生物信息学预测MC4R蛋白功能发现,绵羊的MC4R蛋白存在7个跨膜螺旋结构域,同时预测MC4R存在10个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。结果表明,MC4R是一个非常保守的蛋白,在绵羊的生长发育中起着重要作用。     

三黄鸡ST3Gal6基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对三黄鸡ST3Gal6基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考三黄鸡ST3Gal6基因序列设计引物,采用PCR技术克隆三黄鸡ST3Gal6基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的三黄鸡ST3Gal6基因全长1169 bp,含有1059 bp的完整CDS编码区,编码352个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与人、黑猩猩、牛、大鼠、蟾ST3Gal6基因对应序列的同源性分别为62%、62%、61.9%、59%、54.4%。组织表达谱分析表明,ST3Gal6基因在各组织均不同程度地表达,其中在大脑表达量很高,肺脏中最低。生物信息学预测ST3Gal6蛋白结构发现,三黄鸡的ST3Gal6蛋白存在2个跨膜螺旋结构域,同时预测ST3Gal6存在22个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。     

西农萨能奶山羊乳腺组织LXRα基因CDS的克隆及序列分析

肝脏X受体α(LXRα)基因是核受体超家族的成员之一,可由巨噬细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、肠细胞等脂类代谢旺盛的细胞产生.LXR是调控胆固醇降解、吸收、从外围细胞中逆向转运、脂肪酸代谢及脂肪生成的关键酶.研究基于牛的LXRα基因序列,应用RT-PCR技术从西农萨能奶山羊乳腺组织中克隆LXRα基因编码区序列(CDs),并对测序结果进行生物信息学分析.LXRα基因完整编码区全长1 344 bp,编码447个氨基酸,西农萨能奶山羊LXRα基因CDs区核苷酸序列与牛、猪、小鼠、大鼠、人LXRα转录本1、2、3的LXRα基因CDs区核苷酸序列的分别为98%、93%、87%、87%、90%、79%、90%,山羊LXRα基因与牛LXRα基因存在23个核苷酸位点差异和6个氨基酸差异.     

隆林山羊SMPX基因克隆及其组织表达谱分析

为了探究小肌肉蛋白(Small Muscle Protein X-link,SMPX)在隆林山羊中的蛋白结构和组织表达水平,本研究克隆隆林山羊SMPX,并进行生物信息和组织表达谱分析。从NCBI查找山羊SMPX基因序列设计引物,根据TRlzol法提取1月龄隆林山羊心、肝、脾、肺、肾、背肌的总RNA,反转录成cDNA,并克隆SMPX,通过qRT-PCR分析SMPX在不同组织中的表达水平,进行生物信息学分析。SMPX基因编码区序列全长253bp,共编码255个氨基酸,与NCBI上山羊编码区序列同源性达100%。SMPX蛋白的分子质量20.61ku,等电点为5.29,是酸性蛋白,其在1～22个氨基酸处具有信号肽。SMPX有11个磷酸化位点,在隆林山羊不同组织中的表达量不一样,推测它可能在不同组织中发挥不同的生物学作用。     

山羊PPARα基因克隆、分子特性及组织差异表达分析

试验旨在克隆山羊过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferators-activated receptors-alpha,PPARα)基因的CDS区序列,分析其编码蛋白的结构与功能,并探讨其在山羊不同组织中的表达模式。采用RTPCR方法扩增并克隆PPARα基因CDS编码区;通过在线软件对其一级结构、二级结构和三级结构进行生物信息学分析;利用基因序列和编码蛋白构建系统发育树,进行系统发育进化分析;采用实时荧光定量PCR方法检测PPARα基因在简州大耳羊心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏和网膜6个组织中的相对表达情况。结果表明,山羊PPARα基因CDS区全长1 413bp,结构稳定,共编码470个氨基酸。生物信息学分析发现,PPARα蛋白是一种结构较为稳定的带负电的亲水性蛋白,以α-螺旋和无规则卷曲为主,无信号肽和跨膜蛋白,属于膜内蛋白。蛋白序列中总共有49个磷酸化位点,9个糖基化位点。保守结构域中含有明显的DBD区域和LBD区域,蛋白结构高度保守。三级结构预测发现其蛋白结构主要为通过长链卷曲连接的2个明显不同的结构区域,结构均以helix螺旋为主。序列比对结果表明,山羊PPARα氨基酸序列与绵羊和牛的同源性最高。实时荧光定量检测结果表明,PPARα基因在肾脏和肝脏中表达量较高,显著高于其他组织(P0.05);在网膜组织和心脏中中度表达,显著高于肺脏和脾脏(P0.05);在肺脏和脾脏中相对低表达;说明山羊PPARα基因可能与体内脂肪氧化、脂质代谢和抗氧化应激等调控功能有关。试验结果为深入研究PPARα基因在山羊中的生理功能和调控机制奠定了理论基础。     

牛SCD1基因的生物信息学分析

本研究利用生物信息学方法分析和预测牛SCD1基因的理化特性和编码产物的结构。结果表明牛SCD1基因编码359个氨基酸,平均分子质量为41.71 k Da;组成蛋白为不稳定的水溶性蛋白,三级结构由α-螺旋和无规则卷曲组成,并且牛SCD1基因氨基酸序列和山羊亲缘关系最近。牛SCD1基因的生物信息学分析为进一步研究牛SCD1基因的遗传特性和生理机制奠定了基础。     

山羊组织蛋白酶L基因克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在克隆山羊组织蛋白酶L(cathepsin L,CTSL)基因,并进一步探讨该基因结构与功能的关系,揭示其组织表达规律。本研究以天府肉羊为试验材料,运用同源序列克隆技术,对山羊CTSL基因进行克隆,并对其进行生物信息学分析及组织表达研究。结果表明,山羊CTSL基因编码区(CDS区)长1005 bp,共编码334个氨基酸;山羊CTSL氨基酸与绵羊的同源性最高(99.10%),其次是牛(96.71%)、猪(90.12%)、人(76.95%)、大鼠(76.12%)、小鼠(75.82%)、青鳉鱼(66.17%)和斑马鱼(61.42%);经预测山羊CTSL可能含有1个Inhibitor_129结构域和1个Pept_C1结构域;山羊CTSL基因在11个组织中均有表达,但在肺脏和肾脏中的表达量显著高于在心肌、肝脏、脾脏、胸肌、腹肌、腿肌、膈肌、眼肌和比目鱼肌中的表达量（P<0.05）。     

云上黑山羊SEMA4G基因克隆与性腺组织中的表达分析

本研究旨在探究信号素蛋白4G(SEMA4G)基因序列特征及其在山羊性腺组织中的表达特性。以云上黑山羊为研究对象，利用PCR技术克隆山羊SEMA4G基因CDS区，并对其结构和功能进行生物信息学分析，结果显示：山羊SEMA4G基因CDS区全长2 535 bp，共编码844个氨基酸；核苷酸序列同源性比对发现，山羊与绵羊同源性最高，为97.1%，与其他物种的同源性均在82%以上，说明SEMA4G基因在进化过程中表现出高度保守性；生物信息学分析结果显示SEMA4G为亲水性蛋白，存在O-糖基化潜在位点22个、潜在的磷酸化位点83个、N-糖基化潜在位点4个以及二硫键位点10个，且该蛋白存在信号肽。预测SEMA4G蛋白高级结构发现其为混合型蛋白，主要由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规卷曲组成，其中以无规卷曲为主。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测SEMA4G基因在山羊不同性腺组织中的表达特征。性腺轴组织表达谱分析显示，山羊SEMA4G基因在卵巢中的表达量最高。高低产云上黑山羊卵巢组织定量分析则显示，SEMA4G在高产卵巢表达量显著高于低产卵巢。综上所述，山羊SEMA4G基因在不同物种中高...     

兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列扩增及其生物信息学分析

本研究根据Genbank载入的普通绵羊血小板衍生生长因子受体样蛋白(PDGFRL)基因序列设计特异性引物。利用PCR技术扩增乌骨绵羊PDGFRL基因编码区片段,经测序后对序列进行比对分析,并采用生物信息学软件对编码区序列和蛋白质结构进行预测。结果表明:兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列全长1128bp,编码375个氨基酸;同普通绵羊进行核苷酸序列同源性比对发现同源性为99.73%,发现3个碱基同义突变;生物信息学分析表明不同物种PDGFRL基因编码区核苷酸序列与氨基酸序列具有较高的保守性;蛋白结构预测显示,PDGFRL蛋白空间结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲构成。     

水牛Keap1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究克隆了水牛Keap1基因的全长编码区,并对其序列进行了生物信息学分析,同时探索了其在水牛各组织中的表达差异。根据GenBank中公布的牛Keap1基因的序列信息,设计特异性引物并扩增出水牛Keap1的目的片段,利用生物信息学分析方法,对测序所得水牛Keap1基因序列、预测蛋白质序列进行了分析,并采用实时荧光定量PCR技术对Keap1基因mRNA在水牛各组织中的表达进行了研究。结果表明,水牛Keap1基因编码区全长1 875 bp,预测编码624个氨基酸;多重分析结果显示,水牛与牛、绵羊、野猪和人Keap1基因的同源性分别为99%、96%、92%和90%;进化树分析表明Keap1在物种间具有较高保守性,不同物种间Keap1序列的差异符合物种间的进化性。对Keap1蛋白质二级结构预测发现,其包含24个α-螺旋、40个β-螺旋、38个T转角和27个无规则卷曲。实时荧光定量PCR结果显示,Keap1基因在水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢和肌肉组织中均有表达,但心脏中表达量最高,肝脏、脾脏中表达量较低。本研究成功克隆了水牛Keap1基因,并进行了相关生物信息学分析及其mRNA在水牛各组织的表达情况研究,为阐明Keap1-Nrf2-ARE信号通路,提高水牛胚胎体外培养的抗氧化能力奠定基础。     

版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列扩增及生物信息学分析

本试验旨在扩增版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列,为进一步研究DLDH基因的表达信号通路及与精子获能和顶体反应发生相关基因的表达调控提供必要的基础。通过提取版纳微型猪近交系睾丸组织RNA,经反转录后获得cDNA,设计特异性引物以扩增DLDH基因的编码区序列,经测序后采用生物信息学软件对编码区序列及氨基酸序列进行生物信息学分析和结构预测。结果表明,版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列全长1 530bp,编码509个氨基酸。生物信息学分析表明,不同物种DLDH基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列具有较强的保守性,DLDH蛋白中存在丰富的磷酸化位点,空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。     

湖羊Lrh-1基因cDNA序列及组织表达谱分析

本研究以湖羊肝脏为材料对肝受体类似物-1(Liver receptor homolog-1,Lrh-1;NR5A2)基因序列进行RT-PCR和RACE测定,并用DNAman、Tmpred、Signal P 3.0、Expasy等生物信息学分析软件和在线工具,对Lrh-1cDNA序列及其蛋白的理化特性、跨膜结构、信号肽和二级结构进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测湖羊Lrh-1基因的组织表达谱。结果表明,湖羊Lrh-1基因cDNA序列全长1 488bp,与牛的核酸序列相似度最高,为98%,编码区共编码495个氨基酸,氨基酸序列与牛、人、马、猴、犬、小鼠、褐鼠的氨基酸同源性分别为98%、97%、96%、97%、97%、86%和86%;Lrh-1mRNA在湖羊脑、消化及生殖系统组织中均有表达且具有组织特异性,其中在下丘脑组织中的表达量相对最高。     

绵羊TPT1基因CDS区遗传结构及组织表达研究

本研究旨在克隆绵羊TPT1基因序列,通过生物信息学分析探究其序列特征及编码蛋白的结构与功能,通过实时荧光定量PCR检测TPT1基因在绵羊不同组织中的空间表达规律。以小尾寒羊为研究对象,PCR扩增获得TPT1的完整编码区(CDS)区并进行测序,对所得序列进行生物信息学分析。结果显示:绵羊TPT1基因CDS为660 bp,编码219个氨基酸,核酸序列与山羊的同源性最高。TPT1蛋白为亲水性蛋白,主要分布在线粒体,存在16个磷酸化位点;二级结构主要包含α-螺旋和无规则卷曲,与预测的三级结构相似。定量PCR结果显示TPT1基因在肾中表达量最高,其次是肌肉、肝、脂肪和肺,在心和脾中表达量最低。结果表明,TPT1基因在生物进化中是保守的,但其表达的蛋白质结构不稳定,在绵羊不同组织中均有表达。     

牛HSL基因的克隆和生物信息学分析

旨在克隆牛HSL基因的CDS序列,并对该基因进行生物信息学、组织表达谱分析。根据GenBank登录的牛HSL基因序列(NM_001080220)设计1对引物,对牛组织样品中的HSL基因CDS序列进行RT-PCR扩增及序列测定;利用半定量RT-PCR方法检测HSL基因在牛各组织中的表达情况;利用生物信息学软件对其所编码的牛HSL蛋白进行分析。结果显示,获得的牛HSL基因CDS全长为2271bp,编码756个氨基酸,与GenBank登录的牛HSL基因同源性最高,为99.9%。HSL蛋白含有一个HSL-Nsuperfamily保守结构域,无信号肽结构,具有疏水性。半定量RT-PCR显示,HSL基因在检测的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、大网膜、皮下脂肪、肌肉8种组织中均有表达,其中在大网膜和皮下脂肪中表达量较高,在肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、肌肉和心脏中度表达。该试验可为研究牛HSL蛋白的结构和功能提供参考。     

版纳微型猪近交系VEGF基因克隆及其组织中转录水平的检测

为克隆版纳微型猪近交系血管内皮生长因子(VEGF)基因并检测该基因在各组织中的转录水平,本研究提取版纳微型猪近交系18种组织RNA,利用RT-PCR方法扩增VEGF基因编码区全长序列,进行克隆测序。利用VEGF基因序列的推导氨基酸序列与牛等8个物种的VEGF氨基酸序列构建物种系统进化树,同时采用半定量RT-PCR方法分析VEGF基因在版纳微型猪近交系18种组织中的转录水平。结果显示,版纳微型猪近交系VEGF基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,与牛等8个物种具有90%以上的相似性,分子系统进化表明其序列与人的关系最近,其次为牛、羊和兔。多组织半定量RT-PCR研究表明VEGF mRNA在版纳微型猪近交系的18个组织中均有转录水平的表达,其中在卵巢、脾脏、心脏、肺脏及皮肤中表达量较高,其他组织中表达量略低。     

隆林山羊SCD基因的克隆及序列分析

为了研究硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因对肌间脂肪组织三酰甘油形成的影响,试验采用克隆隆林山羊SCD基因CDS区序列并进行序列分析的方法,根据Gen Bank中收录的西农萨能羊SCD序列设计引物并进行PCR扩增及克隆测序,利用在线生物信息学软件分析SCD蛋白的序列特性,分析不同物种间SCD基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊SCD基因的功能。结果表明:隆林山羊SCD基因CDS区序列全长1 080 bp,由4个外显子组成,编码359个氨基酸,与牛、绵羊、人的氨基酸相似度分别为94.2%、98.3%、83.8%,并与牛和人具有相似的三级结构。系统进化树显示,隆林山羊与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与鸡的亲缘关系较远。     

水牛转录抑制因子CTCF基因克隆分析及不同组织中的表达研究

本研究克隆了水牛转录抑制因子CTCF基因序列,并运用生物信息学方法对其核苷酸序列的保守性和氨基酸的理化性质、蛋白质结构进行了系统分析,此外还对CTCF基因在水牛不同组织中的表达差异进行了检测。结果表明,应用RT-PCR技术克隆获得了长2239bp水牛CTCF基因序列,其中编码区全长2184bp,编码727个氨基酸,理论蛋白质分子质量82.7ku,等电点为6.57。多重序列比较分析显示,水牛CTCF核苷酸序列与牛、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为99%、96%、96%、94%和92%,结合系统进化树分析结果推测,CTCF基因在不同物种及进化的过程中具有高度的保守性。对水牛CTCF蛋白的二级和三级结构分析结果发现,其存在连续11个锌指C2H2结构,预测其为重要的DNA结合蛋白。定量表达分析结果显示,CTCF在水牛肝脏组织中相对表达量最高,大脑、肌肉和肾脏次之,卵巢和皮肤表达量较低。     

山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建

本研究旨在克隆山羊GATA3(GATA binding protein 3)基因,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析。以山羊GATA3基因编码区为种子序列(GenBank登录号:XM_018056969.1),通过SnapGene 4.1.9软件设计引物序列,应用RT-PCR方法扩增山羊GATA3基因完整编码区序列,测序鉴定后基于其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒。利用脂质体转染方法将慢病毒重组质粒pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1与病毒包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pNRF共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒包装后收集病毒上清液,成功感染山羊耳尖成纤维细胞。结果显示,山羊GATA3基因编码区序列全长1335 bp,编码444个氨基酸,分子质量为47.94 ku,分子式为C2093H3234N626O625S24,等电点为9.47,其中丝氨酸含量最高(13.3%),色氨酸含量最低(1.1%)。山羊GATA3基因核苷酸序列与牛、猪、驴、马、小鼠及人的相似性分别为97.7%、94.2%、92.2%、92.4%、88.0%和90.1%,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性。系统进化树分析表明,山羊与牛、猪、驴、马及人聚为一支,亲缘关系较近,与非洲蟾蜍、斑马鱼亲缘关系较远。跨膜结构域及亲/疏水性预测结果显示,山羊GATA3蛋白不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明,该蛋白定位于细胞质中。通过构建山羊GATA3基因慢病毒真核表达载体pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1,细胞水平上转染HEK-293T和山羊耳尖成纤维细胞,过表达GATA3基因,产生绿色荧光信号。本研究结果为山羊GATA3基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究GATA3基因在山羊泌乳中的作用奠定了基础。     

山羊ACSS2基因的克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对山羊乙酰辅酶A合成酶2(acetyl-CoA synthetase 2,ACSS2)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量变化。以山羊乳腺组织RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增并克隆山羊ACSS2基因完整CDS区序列,对测序结果进行生物信息学分析,并对ACSS2基因在山羊不同泌乳时期乳腺组织中的表达量进行分析。结果显示,山羊ACSS2基因CDS区序列长2 106 bp,编码701个氨基酸;山羊ACSS2基因与牛、马、人、犬、猪、小鼠和鸡的同源性分别为97.8%、92.0%、91.3%、91.3%、91.1%、88.1%和73.3%。蛋白理化性质分析结果表明,ACSS2蛋白分子质量为78.72 ku,理论等电点为6.03,属于酸性蛋白;跨膜结构和信号肽分析表明,ACSS2蛋白不含跨膜结构和信号肽;结构域分析表明,该蛋白含有1个乙酰辅酶A合成酶N端结构域。亚细胞定位分析结果表明,该蛋白主要分布在内质网(44.4%)、线粒体(33.3%)、细胞质(11.1%)和细胞核(11.1%)中。蛋白质结构预测发现ACSS2蛋白含有α-螺旋(29.10%)、延伸链(21.54%)、β-转角(9.84%)及无规则卷曲(39.52%)。实时荧光定量PCR分析结果表明,ACSS2基因在不同泌乳时期均有表达,其中在泌乳中期表达量最高,在干奶期表达量最低。本试验结果为进一步研究山羊ACSS2基因在脂质代谢过程中的功能及转录调控机制提供了参考。