山羊溶酶体α-AMA基因的克隆、生物信息学及组织表达谱分析

本研究旨在对山羊溶酶体α-甘露糖苷酶(α-AMA)基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考牛α-AMA基因序列设计引物,采用PCR技术克隆山羊α-AMA基因序列,并利用荧光定量RT-PCR进行组织表达谱分析以及进行生物信息学预测。首次获得了山羊α-AMA基因,含有完整CDS编码区3 000bp,编码999个氨基酸,其中前50个氨基酸为信号肽序列。其编码区的核苷酸序列和预测氨基酸序列与牛的α-AMA相似性最高,分别为95.93%和94.79%。组织表达谱分析表明α-AMA在山羊各组织均不同程度的表达,其中在肺脏、肝脏、小脑表达量较高。生物信息学预测发现,α-AMA蛋白属于糖苷水解酶38家族成员,有2个保守的结构域,存在9个N-糖基化位点。SWISS-MODEL同源建模山羊α-AMA具有良好的可信度。本研究为探讨酶的作用机理及疯草解毒剂的研制提供了理论依据。     

猪β2肾上腺素能受体基因克隆及穿梭表达质粒的构建

【目的】利用重组β₂肾上腺素能受体（β₂AR）检测β₂激动剂类药物,是弥补传统免疫学检测方法不足、实现该类违禁物多残留的快速检测手段。获得高纯度、高亲和力的重组受体是该技术的核心和难点。本文克隆猪β₂ AR并构建其重组穿梭表达质粒,为筛选最适宜的受体表达系统和表达条件提供基础材料。【方法】克隆猪β₂AR并进行序列分析,完成重组穿梭表达质粒构建。首先采集新鲜猪肝组织,提取总RNA,根据GenBank已登录的猪β₂AR核苷酸序列（AF000134）,设计1对引物并进行RT-PCR扩增。扩增产物切胶回收后与pMD-18T载体于4℃、T4连接酶作用下连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选后提取克隆质粒并对其作PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析。然后对所获得的基因及编码的氨基酸序列进行在线BLAST分析、系统进化树构建和疏水性分析。为了提高受体蛋白的表达量及受体配体间的亲和力,对该克隆基因作N端截短186个核苷酸改造;为使表达蛋白C端携带6×His标签,对克隆基因C端进行去除终止子改造。将改造后的克隆基因分别插入pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体,连接产物转入NovaBlue感受态细胞,经Amp抗性筛选,挑取单菌落提取质粒并进行鉴定。【结果】经分光光度计检测及琼脂糖凝胶电泳分析,所提猪肝细胞总RNA的纯度、浓度及完整性可满足后续试验要求。RT-PCR产物电泳结果显示,在1 200 bp 左右出现1条特异性条带,与预期结果一致。克隆质粒pMD-18T-β₂AR经鉴定,证实为阳性重组质粒。测序结果显示,所得猪β₂AR基因cDNA序列全长1 257 bp,编码418个氨基酸。该序列已提交至GenBank,登录号为KF023571.1。Compute pI/Mw在线软件预测该蛋白分子质量为46.73 kD。与已发表的猪β₂AR（AF000134）相比,基因序列一致性为99.68%,4处发生碱基突变,编码的氨基酸序列一致性为99.28%,3处发生突变,且配体与受体结合位点处的氨基酸均得到正确克隆。在线BLAST分析表明,猪与其它物种的β₂AR及氨基酸序列一致性均在80%以上,具有较高的同源性。由系统进化树分析可知,所克隆的猪β₂AR与领西猯Pecan tajacu（JN 633666.1）的亲缘性较近,与大仓鼠Tscherskia triton（AY683091.1）和草原田鼠Microtus ochrogaster（XM 005356183.1）的亲缘性较远。氨基酸疏水性分析表明,该受体蛋白N端以疏水性氨基酸为主,C端以亲水性氨基酸为主。经PCR和双酶切鉴定以及测序分析证明,成功构建重组穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β₂AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β₂AR63-418。【结论】所获克隆基因与已发表猪β₂AR高度一致,且活性位点处的氨基酸均得到正确克隆。此外,pTriEx-1.1 Hygro穿梭表达载体适宜用作大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统的启动子,是研究目标基因在不同表达系统表达效果的良好材料。本文所构建的穿梭表达质粒pTriEx-1.1Hygro-β₂AR1-418和pTriEx-1.1Hygro-β₂AR63-418均可用于以上3种表达系统中β₂AR蛋白的表达纯化研究。     

疯草内生真菌FEL3生产SW培养基的最佳碳氮比优化

为探讨碳氮比对甘肃棘豆(Oxytropis kansuensis)内生真菌FEL3产苦马豆素(Swainsonine,SW)的影响,利用单因素试验对最佳碳源和氮源进行了筛选。结果表明:蔗糖和蛋白胨分别是理想的碳源和氮源;采用中心组合设计(Central Composite Design,CCD)考察液体培养基中蔗糖和蛋白胨的比率对内生真菌FEL3产SW的影响,并利用Design-Expert 7.1.6软件模拟得到二次多项式回归方程的预测模型;当蔗糖为1.47 g·L^-1,蛋白胨为0.29 g·L^-1时,SW浓度达到最大值6.71×10^-4mol·L^-1。试验结果将为利用疯草内生真菌FEL3批量生产SW提供技术支持。     

呋喃丹降解菌的研究进展

呋喃丹是一种高残留、高毒性、难降解的有机杀虫剂,目前在我国的广泛使用,常造成环境污染和人畜中毒。近几十年来,国内外在呋喃丹的毒性危害和降解方面,尤其是细菌降解方面做了大量的研究工作,本文对呋喃丹的毒害、降解菌的筛选、降解机理、降解酶、构建基因工程菌等方面进行了综述。     

产萱草根素内生真菌的分离与鉴定

为探讨萱草(Hemerocallis)根中是否存在产生萱草根素的内生真菌,从北萱草(H.esculenta)根中分离得到4株内生真菌,在马铃薯(Solanum tuberosum)葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养20 d后收集菌丝,应用薄层色谱法和紫外分光光度法分别检测菌丝提取液中的萱草根素,筛选可产生萱草根素的内生真菌。结果表明:菌株XC-1A为产萱草根素内生真菌,含量达359.88 μg·g^-1,根据形态学观察和5.8S rDNA-ITS序列分析结果,确定XC-1A为Zalerion varium。北萱草中存在可产生萱草根素的内生真菌。     

苦马豆素抑制α-甘露糖苷酶的剂量效应关系

根据苦马豆素(Sw)抑制α-甘露糖苷酶(AMA)的特点,建立了SW抑制AMA的剂量效应关系曲线和酶法测定SW溶液浓度的方法.SW溶液浓度范围在5×10-8mol/L～5×10-6mol/L时,SW溶液浓度的负对数与其抑制AMA活性百分比呈线性关系,线性方程Y=0.026X+5.167 4,R2=0.994 7.建立了酶...