抑制14-3-3ξ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ξ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒.[方法]设计靶向14-3-3ξ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果.从psiRNA质粒上扩增H1-si￡基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlul酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达.[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装.[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ξ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3￡相关的体内、外研究提供了试验基础.     

重组马立克病病毒CVI988/Rispens的构建

根据Ⅰ型马立克病病毒（MDV）强毒GA株基因序列,设计两对引物,用PCR方法扩增出CV1988／Rispens株的US10及其侧翼序列,分别克隆入pUC18载体中。经测序检测正确后,进一步插入含CMV启动子的绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒,获得了含EGFP报告基因的转移载体质粒pPUC18-US10-EGFP。通过同源重组,成功地筛选出表达EGFP的重组病毒rCV1988-EGFP,经传代证明重组rCV1988-EGFP在感染的CEF细胞中能稳定表达EGFP。结果表明：构建的重组转移载体质粒正确,US10是MDV复制非必需片段,为进一步利用US10区构建重组MDV多价基因工程疫苗奠定了基础。     

靶基因Bi-1RNAi重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建靶向人Bax Inhibitor-1（Bi-1）基因的shRNA慢病毒重组载体。方法借助siRNA设计工具,并结合文献资料选取Bi-1基因编码序列中有效的干扰靶点,根据连接载体中的酶切位点自行设计并人工合成干扰靶点的一对反义脱氧寡核苷酸链,先定向克隆到pU6载体（pU6-Bi-1-shRNA）,再经双酶切后克隆到慢病毒包装质粒LunIG,得到靶向Bi-1基因沉默的慢病毒包装重组质粒LunIG-Bi-1。重组质粒经PCR法进行初筛后,再通过双酶切电泳和目的基因沉默效果的检测保证插入序列的正确性。结果靶向沉默Bi-1基因的shRNA序列成功插入到慢病毒包装质粒LunIG中。结论靶向Bi-1基因沉默的慢病毒shRNA包装重组质粒构建成功。     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

[目的]研究靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定：[方法]设计并人工合成靶向PRRSV核蛋白N基因的3个siRNA靶序列,将其插入CMV启动子下游,克隆到真核表达载体pSilencer4．1-CMV中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。[结果]成功构建了靶向核蛋白基因表达的siRNA干扰重组质粒载体pSilencer—N。[结论]该研究为进一步运用RNA干扰技术进行PRRSV防治研究奠定了基础。     

AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10~(12)vg/mL。     

JSRV-env慢病毒过表达载体构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

为研究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)囊膜蛋白(Envelope,env)对NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)增殖的影响,构建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒过表达载体并感染NIH3T3细胞。将JSRV-env基因连接红色荧光慢病毒报告载体pCMV-dR8.91,基因测序正确后将载体命名为pCMV-dR8.91-JSRV-env。将pCMV-dR8.91-JSRV-env重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装产生JSRV-env重组慢病毒。将重组慢病毒悬液利用超速离心沉淀法浓缩,real-time PCR测定病毒滴度。浓缩病毒转导NIH3T3细胞72h后,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况。结果显示:env同源重组入pCMV-dR8.91载体,测序结果与预期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env与包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞72h,real-time PCR验证JSRV-env过表达极显著(P0.01),JSRV-env重组慢病毒平均滴度为2.99×10~8 IU/mL;MTT分析显示10μg JSR-env慢病毒感染NIH3T3细胞72h显著促进NIH3T3细胞增殖(P0.05)。综上,成功构建了JSRV-env慢病毒过表达载体,证实JSRV-env能够促进NIH3T3细胞增殖。     

多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建

[目的]探索多角体病毒的包装特性,构建能形成多角体包裹外源蛋白的polyh+Bac-to-Bac表达系统。[方法]通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为标记的绿色荧光基因EGFP,Bm CPV自身的多角体蛋白基因,用于基因表达的H1信号肽柔性连接肽,插入到质粒Fast Bac Dual中,利用Ac MNPV Bac-to-Bac系统,得到整合表达重组Bacmid:Ac-polyh/EGFP。将其感染Sf9细胞后,检测蛋白表达情况。[结果]利用该系统构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)和能在胞质形成多角体的重组病毒v Bm Bac(polyh+)-EGFP。感染的Sf9细胞在荧光显微镜下观察发现EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达;从感染的Sf9细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。[结论]该表达系统为解决活性蛋白长期保存提供了新方法,同时拓宽了杆状病毒在开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体等领域的应用前景。     

表达外源绿荧光蛋白的重组犬2型腺病毒的构建及其生物学特性分析

以pUC18载体为骨架质粒,犬2型腺病毒(canine adenovirus 2,CAV-2)Tomnto A26/61株为亲本毒株,以复制非必需区E3的侧翼序列为同源重组臂,对外源基因的插入靶点E3区进行了缺失,并在缺失位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点,增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)、SV40早期转录poly-A信号,构建了E3区缺失的转移栽体pUC-△E3-EGFP.该载体与CAV-2亲本毒株共转染MDCK细胞,二者发生同源重组,经蚀斑筛选获得了表达EGFP的重组病毒rCAV-2△E3-EGFP.经鉴定重组病毒保持了亲本毒株的生物学性状并能够稳定表达外源基因,动物试验证实E3区的缺失对病毒的致病力无明显影响,为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台.     

小鼠CHD5基因siRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建小鼠染色质区解旋酶DNA结合蛋白5(CHD5)基因干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)重组腺病毒载体并在NIH3T3细胞中验证其干扰作用.方法:人工合成靶向CHD5的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法插入到穿梭载体pSES-HUS上,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,得到pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA重组质粒,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Adr-simCHD5,然后感染NIH3T3细胞,用RT-PCR和Western Blot方法检测其对CHD5mRNA和蛋白表达的干扰效果.结果:得到高滴度Adr-CHD5siRNA重组腺病毒,RT-PCR和Western Blot结果表明该重组腺病毒能有效地降低CHD5基因的表达.结论:成功构建Adr-CHD5siRNA重组腺病毒载体,并在NIH3T3细胞上实现CHD5基因表达抑制,为进一步研究CHD5基因功能奠定了基础.     

siRNA抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中复制的研究

选取口蹄疫病毒(FMDV)的VP1、IRES、2B、3D和L基因保守序列,设计、合成siRNA,并成功构建表达siRNA的穿梭载体,通过脂质体2000在BHK-21细胞上转染6个重组siRNA表达质粒,观察其对FMDV S72毒株复制的抑制效果.结果发现:病毒对照和空载体对照细胞死亡脱落,脂质体2000对照和细胞对照细胞状态良好; 6个siRNA转染孔细胞状态明显优于病毒对照孔,表明6个重组质粒转染后均可以显著抑制FMDV S72毒株的复制,其中靶向IRES1基因的siRNA对FMDV的复制抑制最为明显.     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体的构建与鉴定

利用RNA干扰在线生物学软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列(其结构特征为正链(19nt)-环(9nt)-负链(19nt))。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体中,构建重组载体pGene-NS3-1,pGene-NS3-2和pGene-NS3-3,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行kan+筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒测序。结果显示,双链干扰片段克隆方向正确,序列中未出现核苷酸的插入,缺失等突变现象。表明靶向猪瘟病毒NS3基因shRNA干扰载体构建成功。     

含O型FMDVP1-2A、3CC基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMDI8-T载体,分别得到重组载体pUCll9-P1-2A和pMDI8-T-3C;将重组载体pUCll9-P1-2A用HindⅢ、BamH I酶切,重组载体pMDI8-T-3C用BamH I、Nhe I酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamH I酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMDI8-T-P1-2A-3C.,将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

含O型FMDVP1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建

采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

家蚕miR-14的上调表达与靶基因的预测分析

【目的】了解家蚕细胞中上调miRNA的方法及靶基因预测,为家蚕miRNA的功能研究提供方法参考。【方法】构建家蚕miR-14的真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14并在家蚕BmN细胞中表达,同时通过转染化学合成的miRNA mimics上调BmN细胞中miR-14的水平。首先通过PCR扩增miR-14的前体及其侧翼序列（pri-mir-14）并克隆至真核表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP的EGFP基因下游。分别将重组质粒pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14、对照质粒pSK-hr3-ie1-EGFP、bmo-miR-14 mimics和negative control mimcs转染至家蚕BmN细胞,观察EGFP及FAM在细胞中的荧光情况,以检测其转染效率,qRT-PCR方法检测bmo-miR-14在细胞中的水平。分别采用RNAhybrid和miRanda预测bmo-miR-14的靶基因。【结果】重组表达载体pSK-hr3-ie1-EGFP-pri-mir-14与miRNA模拟物bmo-miR-14 mimics都能上调BmN细胞中的miR-14水平,与对照相比分别提高了2.1、984倍。利用生物信息学方法预测bmo-miR-14靶基因,RNAhybrid和miRanda分别预测得到153和171个潜在bmo-miR-14靶基因,其中两者共同预测的靶基因有49个。GO分析结果显示,预测的49个靶基因的分子功能集中于结合和催化;而生物学过程集中于细胞过程和代谢过程。【结论】通过转染重组质粒及化学合成miRNA mimics,使细胞中相应的miRNA上调,可用于bmo-miR-14后续的功能研究。     

牛白细胞介素-17真核表达载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的表达

【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达.     

小鼠p300-HAT真核表达质粒的构建

[目的]构建小鼠p300-HAT的真核表达质粒。[方法]利用PCR技术扩增p300的HAT域,然后构建p300的HAT域的真核表达质粒（p300-HAT—EGFP）,并通过PCR验证和酶切验证重组质粒的正确性;提取不舍内毒素的质粒,转染HepG2细胞,通过观测绿色荧光检测转染效率。[结果]PcR产物的电泳结果显示,成功扩增了小鼠p300基因HAT结构域,构建了小鼠p300基因HAT结构域的真核表达质粒,将其命名为m-p300-HAT-pEGFP—C1。重组质粒可以成功表达融合绿色荧光蛋白目的基因蛋白。[结论]p300-HAT—EGFP重组质粒的成功构建为后续开展巨噬细胞NF—kB信号通路的研究奠定了基础。