慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

慢病毒载体介导稳定表达Cpf1的细胞系的构建及其基因编辑效率验证

【目的】通过慢病毒转染细胞构建稳定表达CRISPR/Cpf1的293 T和HT 1080细胞系,实现高效率基因编辑。【方法】PCR扩增AsCpf1和LbCpf1基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共转染293FT细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达LbCpf1和AsCpf1的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。用设计好的针对ABCG1基因的sgRNA转染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。【结果】成功构建了Cpf1-pLent慢病毒载体,重组载体对293 FT细胞进行慢病毒包装、浓缩与纯化后,病毒滴度均在10~6 TU/mL之上。用纯化后的病毒感染293 T和HT 1080细胞,筛选出3株能稳定表Cpf1的细胞系,目的ABCG1基因的基因编辑功能验证表明其中2株T7EΙ酶切掉带明显,sgRNA靶向敲除效率较高,命名为AsCpf1-293 T-7D和AsCpf1-HT1080 02-3B。【结论】建立了稳定表达Cpf1的293T和HT 1080细胞细胞系,可以用于目的基因的高效敲除。     

猪细小病毒NS1基因真核表达载体pEGFP-N1-NS1的构建与表达

根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。     

番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。     

口蹄疫病毒L基因真核表达载体的构建及表达

采用RT-PCR方法,从口蹄疫病毒中扩增出长约600 bp的核苷酸片段.纯化后与载体pMD18-Tsimple连接,重组质粒经PCR鉴定及DNA测序,结果表明克隆的片段为口蹄疫病毒L基因.将质粒pMD18-L与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoLⅠ双酶切,将所获目的基因与带有酶切位点的载体连接,经酶切、PCR鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒pEGFP-L构建成功.将转染的BHK-21细胞,经荧光鉴定和RT-PCR检测,证实L基因在BHK-21细胞中得到表达.     

秦川牛ADIG基因重组腺病毒过表达载体的构建与病毒包装

【目的】构建秦川牛ADIG基因的重组腺病毒载体,包装并扩繁病毒,为下一步研究该基因在脂肪细胞分化过程中的分子作用机制和相关信号通路奠定基础。【方法】根据NCBI收录的家牛ADIG基因(NM_001113720.1)mRNA序列设计引物,以秦川牛组织样提取的总RNA反转录而成的cDNA为模板,通过RT-PCR和PCR扩增获得目的基因,将其连接到pMD19-T Simple载体并测序。质粒提取纯化后通过BglⅡ与SalⅠ双酶切,然后胶回收酶切产物,将其连接到穿梭载体pAdTrack/CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack/CMV-ADIG。将pAdTrack/CMV-ADIG质粒用PmeⅠ酶切线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAD-ADIG,并用PacⅠ酶切鉴定,提取质粒后转化大肠杆菌Top10进行扩繁。用PacⅠ酶切线性化pAD-ADIG载体并回收质粒大片段,转染293A细胞进行病毒包装,然后完成病毒扩繁和病毒滴度的测定。【结果】PCR扩增获得了399bp ADIG基因CDS区;成功构建了重组穿梭质粒pAdTrack/CMVADIG和重组腺病毒质粒pAD-ADIG。经检测,ADIG重组腺病毒包装成功,扩繁后得到了高滴度的腺病毒(1×108PFU/mL)。【结论】成功构建了秦川牛ADIG基因的重组腺病毒表达载体pAD-ADIG,完成了病毒包装和扩繁。     

心肌特异性α-actin启动子重组腺病毒的构建及其鉴定

为了探讨心肌肌动蛋白(α-actin)基因启动子的心肌组织特异性及其表达活性,构建了心肌组织靶向性表达的基因载体,应用PCR从pEGFP-N1-α-actin-P质粒中克隆出α-actin启动子片段,将其插入到切除CMV启动子的腺病毒穿梭载体pAdTrack中,构建出pAdTrack-actin重组穿梭载体,经酶切和测序鉴定正确后用PmeI线性化,与含有腺病毒骨架DNA的pAdEasy-1质粒在BJ5183大肠杆菌细胞中同源重组成新的重组体pAd-easy-actin,抽提重组体DNA,经PacI酶切回收后以脂质体法转染人胚肾细胞株HEK293,包装出完整腺病毒pAd-actin进行PCR检测,并应用蚀斑形成试验测定病毒滴度。结果显示,重组腺病毒中含有α-actin启动子片段,病毒滴度为7×107pfu/mL。表明含心肌α-actin启动子的重组腺病毒pAd-actin构建成功。     

NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。     

猫多能性基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

从含有猫Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的质粒中获取目的基因,将目的基因与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体LV5进行定向连接,构建慢病毒表达载体LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4、LV-c-Myc,将其连接产物分别转化至细菌感受态细胞中,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后测序,通过lipofectamine2000介导转染293T细胞对慢病毒进行包装并测定病毒滴度,探讨猫多能性基因Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc慢病毒载体的构建与包装。结果表明:经双酶切鉴定及测序分析,成功构建并包装出LV-Oct4、LV-Sox2、LV-Klf4及LV-c-Myc慢病毒载体,基因测序结果与目标序列完全一致,且病毒滴度均达到107 TU·mL-1以上。说明成功地构建了猫多能性基因慢病毒表达载体,获得稳定产生慢病毒颗粒的包装细胞株。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

慢病毒法建立稳定表达HPV-16 E6癌蛋白的肺癌细胞株

目的方法结果结论（HPV）-16 E6DNA HPV-16 E6（PLIG）（PLIG-E6）293T NCIH460 G418 4 DNA PCR Western blotting NCIH460 HPV-16 E6 DNA NCI-H460 HPV-16 E6 DNA HPV-16 E6探讨慢病毒法建立人乳头瘤病毒癌蛋白表达肺癌细胞株的可行性。采用重组技术将基因插入到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒质粒载体中,获得重组慢病毒载体,经双酶切和测序鉴定正确后,与慢病毒包装载体一起转染细胞,收集病毒液,测定滴度后,感染肺癌细胞株。经筛选培养周后,提取细胞基因组和蛋白,分别用和方法分析细胞中和蛋白的表达。双酶切及测序结果表明重组慢病毒表达载体构建成功;感染慢病毒液的细胞中可检测出和蛋白表达。用慢病毒法成功构建稳定高表达癌蛋白的肺癌细胞株。     

鸡卵清蛋白启动子慢病毒载体构建及荧光定量PCR检测重组慢病毒滴度

构建鸡卵清蛋白启动子(OV 2.8kb)与含有eGFP基因的慢病毒表达载体,采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测重组慢病毒滴度。将鸡卵清蛋白启动子基因OV连接到慢病毒载体p LVshRNA-eGFP中替换质粒上CMV promoter元件,经酶切、测序鉴定获得携带OV与eGFP融合基因的重组慢病毒质粒,用QPCR检测病毒浓度滴定。结果显示,重组慢病毒质粒p LVshRNA-OV-eGFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的OV基因序列完全一致。在QPCR试验过程中,发现空白组和载体组的溶解曲线和扩增曲线较好,证明基因组抽提和QPCR过程无问题。最终测得病毒滴度约为1.6×10~7IU/m L。成功构建了携带OV与eGFP融合基因的慢病毒表达载体,为进一步研究卵清蛋白启动子基因的相关功能提供了优质的稳定转染载体。     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

人B7-H4慢病毒表达载体的构建

目的构建人B7-H4慢病毒表达载体。方法将RT-PCR扩增的B7-H4基因全长编码序列克隆到慢病毒转移载体,通过脂质体转染293细胞,包装成人B7-H4慢病毒颗粒。RT-PCR、流式细胞术和Western blot鉴定B7-H4在重组慢病毒感染293细胞中表达,50%组织培养感染剂量法（TCID50法）检测重组慢病毒滴度。结果成功构建了pMD18-T-hB7-H4质粒和pEZ-Lv105-hB7-H4质粒。基因测序分析证实人B7-H4编码序列成功整合到质粒载体。TCID50法测定Lenti-hB7-9H4慢病毒滴度为1.7×10^9 copies/mL。RT-PCR、流式细胞术和Western blot证实Lenti-hB7-H4慢病毒转染细胞后可有效表达人B7-H4 mRNA和蛋白质。结论成功构建了表达人B7-H4的慢病毒颗粒。     

JSRV-env慢病毒过表达载体构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

为研究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)囊膜蛋白(Envelope,env)对NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)增殖的影响,构建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒过表达载体并感染NIH3T3细胞。将JSRV-env基因连接红色荧光慢病毒报告载体pCMV-dR8.91,基因测序正确后将载体命名为pCMV-dR8.91-JSRV-env。将pCMV-dR8.91-JSRV-env重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞包装产生JSRV-env重组慢病毒。将重组慢病毒悬液利用超速离心沉淀法浓缩,real-time PCR测定病毒滴度。浓缩病毒转导NIH3T3细胞72h后,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖情况。结果显示:env同源重组入pCMV-dR8.91载体,测序结果与预期序列一致;pCMV-dR8.91-JSRV-env与包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞72h,real-time PCR验证JSRV-env过表达极显著(P0.01),JSRV-env重组慢病毒平均滴度为2.99×10~8 IU/mL;MTT分析显示10μg JSR-env慢病毒感染NIH3T3细胞72h显著促进NIH3T3细胞增殖(P0.05)。综上,成功构建了JSRV-env慢病毒过表达载体,证实JSRV-env能够促进NIH3T3细胞增殖。     

过表达及RNA干扰糖尿病相关锚定重复序列蛋白基因腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含糖尿病相关锚定重复序列蛋白(DARP)基因的重组腺病毒过表达及RNA干扰载体.方法 应用PCR技术扩增大鼠DARP基因序列,设计并合成shRNA序列,分别插入表达载体GV-314和GV-119,经基因测序鉴定.用重组DARP过表达和shRNA表达穿梭载体与辅助包装质粒pBHGloxAE 1共转染人胚肾细胞HEK293,进行病毒包装、出毒和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度.用重组腺病毒感染大鼠H9c2细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度,Western Blot检测DARP蛋白表达.结果 基因测序显示DARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符,转染HEK293细胞包装成功.DARP过表达和shRNA腺病毒明显影响H9c2细胞中DARP蛋白表达水平.结论 成功构建了大鼠DARP过表达及特异性shRNA腺病毒表达载体.     

弓形虫GRA3基因真核表达质粒的构建与鉴定

以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质粒pVAX-GRA3转染Hela细胞,然后进行RT-PCR检测。RT-PCR结果表明,检测到了目的基因的存在,说明pVAX-GRA3成功转入Hela细胞。     

猪瘟病毒NS3蛋白在真核细胞中的表达与定位

为研究与猪瘟病毒NS3蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,采用PCR方法获得NS3基因,将其定向克隆至pCMV-Myc真核表达载体,经酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pMycNS3。采用脂质体介导法将pMyc-NS3转染至PK-15细胞和293T细胞,Western blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达。结果表明,成功构建重组表达质粒pMyc-NS3,Western blot表明,NS3蛋白在PK-15细胞和293T细胞中均得到表达,NS3在PK-15和293T细胞质中呈弥散性分布。说明,成功构建的猪瘟病毒NS3基因与Myc融合表达质粒,为验证NS3蛋白与宿主细胞蛋白相互作用奠定基础。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。