重组纤维素酶E4酶活性改变的初步研究

纤维素酶F4是一种噬温的丝状土壤放线菌Thermomonospora fusca分泌的一种特殊纤维素酶,对细菌微结晶纤维素(BMCC)有较高的活性,可与T.fusca中典型的外切酶和内切酶协同作用.初步研究显示,其不同底物水解活性与结合域(CBD)有很大关系,因此对F4的CBD进行删除,构建4组重组质粒,转入酵母GS115表达系统表达,得到对应重组蛋白.结果显示,CBD的删除对其温度、pH稳定性都有影响,且不同底物的降解活力有明显变化,对于纤维素酶降解机理复杂性有初步研究.     

肝脏特异性表达载体的构建及Western blotting检测

研究靶向于肝细胞的组织特异性siRNA,实现siRNA基因治疗的组织特异性,可用于特异性治疗乙肝,突破RNA干扰技术在临床应用的一大障碍。用靶向于EGFP的siRNA（以下简称siEGFP）替代靶向于乙肝病毒保守区的siRNA,构建可以在肝细胞中特异性表达的载体,用来表达siRNA。将目标载体分别转染肝癌细胞HepG2、乳腺癌细胞MDB-MB-231、人胚肾细胞293,在蛋白质水平上检验siRNA抑制的组织特异性。Western blotting结果证实,siEGFP在肝组织来源的细胞系HepG2中抑制效率明显高于其他两组细胞。构建的载体可以在肝癌细胞系中特异性的表达siRNA,而在其他组织细胞中不表达,实现了组织特异性。进一步将siEGFP替换为抑制HBV表达的siRNA,同样可以实现肝脏特异性的表达。     

基于Discovery Studio平台纤维素酶E4同源建模

利用Discovery Studio平台以同源建模的方法构建E4的完整三维结构模型,并对其进行结构优化和评估,Ramachandram图谱检测和Verify-3D评估显示模拟出的模型结构合理,整体的相容性较为可信。本结果为今后的纤维素酶E4的深入研究提供了理论依据。     

抑制14-3-3ζ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ζ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒。[方法]设计靶向14-3-3ζ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果。从psiRNA质粒上扩增H1-si-ζ基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlu1酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达。[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功。病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装。[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ζ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3ζ相关的体内、外研究提供了试验基础。     

白蚁纤维素酶结构域重组研究

对来源于白蚁Nasutitermes takasagoensis的纤维素酶NtEG和来源于Thermomonospora fusca的耐热性纤维素酶E4进行同源建模和序列比较,利用重组PCR技术将E4的结合域与NtEG的催化域进行结构域重组,形成重组纤维素酶。并将得到的重组体置于毕氏酵母X33中表达并检测其催化效率。结果表明:重组纤维素酶的相对分子质量约为59 ku;用羧甲基纤维素法、滤纸法、微晶纤维素测得重组纤维素酶的活性分别为17.1、5.4、4.6 U/mL;重组纤维素酶可在毕赤酵母中成功表达。     

抑制14-3-3ξ表达的siRNA及其重组腺相关病毒载体的构建

[目的]通过构建靶向14-3-3ξ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒.[方法]设计靶向14-3-3ξ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果.从psiRNA质粒上扩增H1-si￡基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlul酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP.重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达.[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装.[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ξ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3￡相关的体内、外研究提供了试验基础.