2018—2020年福建地区猪瘟病毒E0基因遗传变异分析

为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况,收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份,采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测,对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示,CSFV总体阳性率为1.9%(29/1464),并获得13株CSFV E0基因序列。同源性分析发现所得13株CSFV E0基因之间的同源性在82.2%-99.7%,其中11株CSFV E0基因与1.1亚型代表毒株HCLV的核苷酸同源性为99.0%～99.9%,与Shimen株的核苷酸同源性94.1%～95.0%;1株与2.1c型参考毒株HNSD-2012核苷酸同源性为98.2%;1株与2.1d亚型毒株CSFV/JPN/2018核苷酸同源性为99.6%。遗传进化分析发现,10株CSFV与HCLV、C-ZJ-2008、Shimen和Brescia处于同一分支,属于1.1亚型;1株CSFV与HNSD-2012等位于同一分支,属于2.1c亚亚型;1株与CSFV/JPN/2018等位于同一分支,属于2.1d亚亚型。氨基酸序列分析发现,13株毒株与HCLV等代...     

广东省猪瘟病毒流行毒株遗传多样性分析

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种严重危害我国养猪业的烈性传染病。病毒囊膜糖蛋白E2是病毒识别和吸附宿主细胞的重要蛋白,同时也是病毒较不保守的蛋白,其编码基因常用于猪瘟病毒的遗传进化分析。为了分析我国猪瘟高发地区—广东省CSFV流行毒株的遗传多样性,本研究利用RT-PCR对采集自佛山等广东省11个城市的CSFV流行毒株E2全长基因进行了扩增和序列测定。系统进化分析表明16株CSFV流行毒株有15株为基因2.1亚型,另外1株属于基因1.1亚型。根据核苷酸同源性的大小,这些2.1亚型病毒株又可进一步划分为3个亚亚型2.1b、2.1c和2.1d。其中2.1c和2.1d亚亚型毒株是首次报道在该地区流行,到目前为止2.1a毒株尚未发现在广东省流行。多序列比对结果表明基因2.1亚型的4个亚亚型具有群特异性的氨基酸替换,这些结果进一步证实了2.1亚型的分型结果。综上所述,基于E2基因序列的系统进化分析和氨基酸多序列比对表明广东省CSFV流行毒株具有遗传多样性,同时发现有新的2.1c和2.1d亚亚型毒株的流行,这些研究结果将为我国广东省猪瘟防控策略的制定提供科学依据。     

湖北地区猪瘟病毒流行株E2基因的序列测定与分析

为分析猪瘟病毒湖北流行株(CSFV-HBWH-2017株)E2基因遗传变化规律,参照Gen Bank公布的CSFV-E2基因序列设计特异性引物,对CSFV-HBWH-2017株E2基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示,E2基因PCR扩增产物大小为1 489 bp,编码496个氨基酸,系统进化树显示HBWH-2017株与Gen Bank参考毒株的核苷酸序列同源性为86.0%~96.0%,与湖南HNLY-2011株同源性高达96%亲缘关系最近,属于同一分支2.1c亚型,表明2.1c毒株已经成为湖北地区流行毒株。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

云南省野猪源猪瘟病毒E2及5'NTR基因序列测定分析

猪瘟（CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）感染猪引起的一种急性、热性、接触性传染病,严重危害我国养猪业健康稳定发展。本研究采用RT-PCR方法,对从云南省宁洱县2头病死野猪体内分离到的2株CSFV毒株进行了E2及5''NTR基因扩增、克隆及序列测定;采用DNAMAN、MEGA6等分子生物学软件,对测得的序列与国内外参考毒株进行了同源性分析及系统发育分析。结果显示：2株野猪源CSFV株E2、5''NTR基因同源性分别为87.2%、100%,与国内外参考毒株同源性分别为81.0%~97.6%、93.6%~98.5%,与我国强毒株Shimen株的同源性分别为81.0%~81.2%、95.6%;2株野猪源CSFV毒株E2基因属于基因2.1亚型,5''NTR基因属于基因2.3亚型。氨基酸序列分析显示：其中一株分离毒株的E2基因有6个氨基酸具有2.1d分子变异特征,另一株兼有2.1d和2.1b亚型分支特征,可能是2.1b和2.1d亚型的过渡毒株。结果表明,云南省野猪源CSFV虽存在一定的遗传衍化,但总体比较稳定。本研究为云南省CSF防控提供了分子流行病学依据,为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。     

山西猪瘟野毒株E_2基因序列测定与遗传变异多样性分析

为了解山西地区猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法,2013年从山西部分地区分离出5株CSFV流行毒株,并进行了E2全基因扩增、克隆与序列测定,应用DNAStar分析软件对所测定的5株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析,绘制系统发育进化树。结果表明：5株CSFV流行毒株之间E2基因核苷酸序列与所推导氨基酸序列的同源性分别为81.4%~100%和87.9%~100%,与CSFV石门毒株（Shimen株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为82.9%~94.8%和89.0%~94.9%,与CSFV兔化弱毒株（HCLV株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.6%~99.6%和87.9%~99.5%,与17株来自各国不同地区的CSFV参考毒株的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.5%~99.6%和86.3%~99.7%。经系统发育关系分析,4株属于基因2群,且705、713、725、729、734和738位氨基酸发生置换,另外1株属于基因1群。本研究揭示了山西猪瘟流行毒株的遗传变异多样性现状。     

2.1c亚群猪瘟病毒GXF29/2013株全基因组克隆测序及遗传进化分析

参考GenBank登录的2.1亚群猪瘟病毒(CSFV)的核苷酸序列,设计并合成4对引物,应用RT-PCR技术,扩增出了CSFV广西流行毒株GXF29/2013的全基因组,并进行核苷酸测序。结果 GXF29/2013株的全基因组长度为12 296个核苷酸。用MEGA5.0软件对GXF29/2013与GenBank上登录的20株不同亚型(1.1、2.1、2.2、2.3和3.4)CSFV参考株进行全基因组核苷酸序列及开放阅读框编码的氨基酸序列比较,发现GXF29/2013与参考株核苷酸序列同源性在83.2%~98.0%之间,氨基酸序列同源性在91.2%~98.8%之间。用E2基因进行系统发生树分析,结果表明GXF29/2013属于最近出现的2.1c亚群。对E2蛋白进行分析,结果表明GXF29/2013株有2.1c亚群毒株的特征,与2.1b毒株的遗传进化关系比与1.1亚群毒株的近。该毒株既保留了CSFV E2蛋白的一些关键特征,又与疫苗毒株的一些关键抗原位点不同。GXF29/2013病毒株全基因序列的获得为下一步进行CSFV反向遗传操作平台的建立奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因的扩增及序列分析

本研究利用RT—PCR技术，对流行于国内部分地区的9株猪瘟病毒（CSFV）E2基因进行扩增，与C-株等4株参考毒株做了同源性比较，绘制了遗传进化关系发生树，结果表明，所测序列共由442个氮基酸残基组成。可将13株CSFV分为两个组群，其E2基因间的核苷酸序列同源性为81．9％～99．7％，所推导氨基酸序列同源性为88．2％～99．5％，其中9株CSFVE2基因的长度均为1324bp，编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和跨膜区序列，9株流行毒株与C-株之间核苷酸序列同源性为81．9％～95．3％。所推导氨基酸序列同源性为88．2％～95．5％。说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性，并且多数毒株已向远离疫菌株方向变异。     

2012—2018年山东省部分地区猪瘟分子流行病学研究

为了解山东省不同地区猪群中猪瘟病毒（CSFV）分子流行病学特点,采用RT-PCR方法,对2012—2018年收集到的79份临床疑似猪瘟病例组织样品,进行E2基因主要抗原区域扩增与序列测定,对获取的59个CSFV E2基因主要抗原区域序列进行遗传演化分析,并构建了遗传发育进化树。结果显示：7株CSFV属1.1亚型,其中有3个毒株的E2基因与疫苗株E2基因几乎一致,提示这7个毒株可能来自疫苗毒或为类疫苗毒株;SDJZ-15株归属2.1b亚型,其 E2基因推导氨基酸仅A51（丙氨酸）突变为V51（缬氨酸）;其他51个毒株属2.1d亚型,与2型CSFV的 E2基因主要抗原区（28~90 aa）氨基酸序列相比发生了4处突变,总体保持稳定。研究结果表明,2.1亚群中的2.1d分支CSFV是山东省当前的优势流行毒株。     

猪瘟病例的综合诊断及感染毒株遗传进化分析

2018年5月,山东省菏泽市某育肥猪场新进仔猪突然出现急性发病死亡,死亡率高达30%以上。为确诊病原,分析病原的遗传演化规律,对病死猪进行了病理组织学诊断和病毒分离鉴定,并对分离株的E2基因进行了序列测定及遗传变异分析。结果显示,组织学病变符合猪瘟的病变特征,与参考毒株核苷酸和氨基酸的同源性分别为83.4%～97.9%和88.7%～98.7%,与本实验室从山东分离的流行毒株的核苷酸和氨基酸同源性均高于其他参考毒株。E2基因遗传进化分析表明,该分离株与本实验室分离的流行毒株遗传距离较近,同属于猪瘟病毒2.1d亚型分支。E2基因推导氨基酸突变位点分析表明,分离株的糖基化位点(T~(806)A)与所有参考株均不相同,其具体生物学意义有待研究。上述结果表明,该猪场仔猪的急性发病死亡是由猪瘟病毒感染所致,致病毒株属于猪瘟病毒2.1d亚型。     

2015年我国部分地区2.1d新基因亚型猪瘟病毒的分子流行病学分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)在我国的流行情况,本研究对2015上半年来自4个省疑似猪瘟(CSF)病料样品采用RT-PCR方法进行检测,28份样品中14份为CSFV阳性,并对这些阳性样品进行CSFV E2基因遗传进化分析。结果表明,14个病毒株中11个属于2.1d新基因亚型,它们与CSFV代表株Shimen、HCLV和2.1b基因亚型病毒株的核苷酸同源性分别为82.8%~84.1%、81.1%~82.4%和92.6%~97.1%,氨基酸同源性分别为89.8%~91.2%、88.2%~89.8%和94.1%~98.9%,其余3个病毒株属于2.1b亚型。这些2.1d亚型新分离株在E2基因的4个氨基酸(R31、S34、K303和A331)上具有相同的分子特征。本研究结果与我们2014年CSFV流行病学研究结果一致,表明2.1d亚型病毒株已成为我国现阶段CSFV的主要流行株。     

辽宁地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解近年来辽宁地区猪瘟流行毒株的遗传变异情况,本试验利用RT-PCR方法对2006年～2011年辽宁地区发病猪群中猪瘟病毒感染情况进行了检测并获得了20株猪瘟病毒E2基因部分编码序列的扩增片段,测序后得到276 bp的E2基因编码序列;并在此基础上利用DNAStar和MegAlign等软件对所测定的20株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对.结果表明,20株猪瘟野毒株分别属于基因2.1、2.2亚型和1.1亚型,其中基因2.1亚型已经成为辽宁地区猪瘟病毒的优势流行毒株.属于基因2.1亚型的猪瘟野毒株与疫苗株之间的同源性在76.8％～80.5％之间,与经典强毒Shimen株的同源性在77.4％～81.1％之间.而病毒E2基因变异位点主要分布在所测序列的前30个氨基酸,与强毒Shimen株、疫苗株相比其变异率高达20％以上.说明近期流行毒株的变异呈现一定的多样性,并且多数毒株已向远离强毒Shimen株、疫苗株方向变异.     

河北省猪瘟病毒分子流行病学调查

为了研究河北省猪瘟病毒(CSFV)遗传变异规律,试验采用RT-PCR方法对河北省CSFV流行毒株E2基因进行扩增并测序,分析其遗传变异。结果表明:河北省CSFV流行毒株分为基因Ⅰ群和基因Ⅱ群,没有检测出基因Ⅲ群毒株。检测到3个基因型,其中起源于欧洲的2.1亚型已成为河北省的主要流行毒株,中国1.1亚型的传统毒株仍然存在,而20世纪80—90年代的基因2.2亚型和2.3亚型很少,有消失的趋势。核苷酸和氨基酸序列同源性分析显示,E2蛋白抗原表位氨基酸位点已发生变异,且疫苗株HCLV1900和流行毒株同源性较低,可能导致疫苗不完全保护。     

福建省一株猪瘟病毒流行毒株全基因组序列测定与分析

根据GenBank公布的猪瘟病毒(CSFV)标准参考毒株全基因组序列,设计11对引物,应用RTPCR方法分别对11个片段进行福建流行毒株CN-FJLY的全基因组扩增,与参考毒株进行序列分析比较。结果表明,福建流行毒株CN-FJLY基因组全长为12 296bp,与参考毒株SXCDK、HEBZ、GXWZ02、HNLY-2011和Zj0801的全基因组核苷酸同源性为93.0%～97.0%,而与1.1亚群的中国强毒Shimen、疫苗株HCLV全基因组核苷酸同源性为84.4%～85.3%。基于全基因组及E2基因构建的遗传进化树分析结果表明福建流行毒株CN-FJLY属于2.1b亚群,与Shimen株、HCLV疫苗株亲缘关系较远。与HCLV相比较CN-FJLY基因组变异较大的是5′UTR、Ems、E2、p7、NS2、NS5A、NS5B和3′UTR。综上说明福建省猪瘟病毒流行毒株正在向远离疫苗株的方向变异。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

猪瘟病毒GZA株的分离鉴定及遗传变异分析

本研究收集贵州规模化猪场猪瘟净化过程中RT-PCR检测阳性病料,采用细胞接毒技术、病毒的形态结构观察和间接免疫荧光试验等分离鉴定了1株猪瘟病毒(CSFV),命名为CSFV GZA株,并对GZA株E2基因的核苷酸和氨基酸序列进行差异性分析。分离鉴定结果表明:接种PK-15细胞后连传7代RT-PCR均能扩增出CSFV特异性条带;病毒粒子在电镜下呈椭圆形或圆形,直径30～80nm;该毒株E2基因与参考毒株E2基因的核苷酸同源性82.8%～83.4%,氨基酸相似度88.7%～90.6%,并在713,725,729,734,738氨基酸位点发生改变;遗传进化树分析还得出GZA株E2基因与参考毒株遗传距离较远。说明本次分离株与其他流行株存在一定的差异,可为以后CSFV病原学的研究提供参考。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析

为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%和82.2%~100.0%,与国内外分离株的核苷酸同源性为81.1%~98.9%,氨基酸同源性为79.8%~95.6%;遗传进化树分析表明,31株CSFV属于1.1和2.1亚群,其中23株为1.1亚型,8株为2.1b和2.1c亚群,没有发现2.2和2.3亚群毒株。氨基酸序列分析表明,流行株在免疫逃逸相关位点705,713,729和734位氨基酸发生变异,FJ02毒株B细胞表位关键位点771位氨基酸发生变异,表明福建地区CSFV流行毒株呈现遗传变异多样性。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767bp,10株为1 768bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株(10084F4、R14040及R14086)的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。     

2017-2019年山东省部分地区猪瘟流行病学调查

为掌握近年来山东地区猪瘟病毒（CSFV）的流行及其遗传变异情况，本研究对2017年1月-2019年12月从山东省济南市、泰安市、聊城市、青岛市等10个地区采集的1 687份疑似猪瘟感染猪病料运用反转录PCR方法进行了病毒核酸检测，将CSFV检测为阳性的样品进行E2基因和CSFV全基因扩增和测序，利用生物信息学软件DNAStar和Mega 7.0对CSFV的E2蛋白以及全基因序列进行遗传进化分析。另外，将这些地区采集的4 866份血清样本进行了抗体ELISA检测。结果显示，1 687份病料中病原检测有188份阳性，总阳性率为11.1%，其中2017-2019年病原检测阳性率分别为8.5%、13.1%、15.1%，抗原阳性率逐年上升且呈不稳定性，提示规模化猪场猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫存在一定的风险和压力；采集的4 866份血清样本中4 146份呈现抗体阳性（85.2%），统计得到2017-2019年抗体阳性率分别为84.3%、83.0%、92.3%，抗体阳性率呈现上升趋势，说明山东省规模化养殖场猪群猪瘟疫苗免疫保护的整体水平逐年提高；从阳性病料中扩增获得了5株CSFV全基因组序列和5株病毒E2基因序列，经过序列比对发现，5株临床分离毒株与2.1d亚型的CSFV全基因组序列同源性在97.5%~99.0%之间，表明5株分离毒株与2.1d亚型的CSFV亲缘性较近，分离毒株氨基酸位点的突变集中在102位（L→M）以及159位（K→R）氨基酸处。本研究分析了2017年1月-2019年12月山东部分地区猪群中CSFV毒株的流行与变异情况，为指导山东省CSFV预防与控制提供了有力的参考。