福建地区猪瘟病毒流行株基因分型及E2基因遗传变异分析

为了解福建地区2013—2014年猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,采集了福建地区多个猪场的40份疑似猪瘟样品,应用RT-PCR技术对E2基因的主要抗原编码区进行扩增及序列分析,其中31份为猪瘟阳性。序列分析结果表明,31株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为78.5%~100.0%和82.2%~100.0%,与国内外分离株的核苷酸同源性为81.1%~98.9%,氨基酸同源性为79.8%~95.6%;遗传进化树分析表明,31株CSFV属于1.1和2.1亚群,其中23株为1.1亚型,8株为2.1b和2.1c亚群,没有发现2.2和2.3亚群毒株。氨基酸序列分析表明,流行株在免疫逃逸相关位点705,713,729和734位氨基酸发生变异,FJ02毒株B细胞表位关键位点771位氨基酸发生变异,表明福建地区CSFV流行毒株呈现遗传变异多样性。     

北京部分地区猪瘟病毒流行株E2基因序列分析

为了解北京地区猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的遗传变异情况,采用套式RT-PCR方法,对从北京部分地区近期分离的7株CSFV流行毒株的E2基因主要抗原编码区进行了扩增、克隆与序列测定,并应用DNA Star分析软件对所测定的7株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明,7株CSFV流行毒株之间核苷酸与氨基酸的同源性分别为96.3%～99.3%和95.6%～100%,与CSFV石门毒株(Shimen株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.7%～83.5%和82.4%～84.6%,与CSFV兔化弱毒株(HCLV株)的核苷酸与氨基酸的同源性分别为80.6%～81.7%和78.0%～80.2%,7株CSFV流行毒株均属于基因2群,且705、713、729和734位氨基酸发生置换。本研究初步揭示了北京部分地区目前流行的CSFV毒株与Shimen株和HCLV株在E2基因主要抗原区上存在较大差异。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒广西流行毒株E0基因的克隆与分析

应用RT-PCR方法对猪瘟病毒E0基因进行扩增、克隆及测序,用DNA Star分析软件对6株毒株与猪瘟兔化弱毒苗(HCLV)、石门(Shimen)株、Paderborn株、GXWZ02株的相应片段进行比较分析,构建了CSFV遗传进化树。序列分析表明,广西流行株与HCLV株、Shimen株、Paderborn株、GXWZ02株之间核苷酸的同源性分别为80.8%~81.5%、82.8%~83.3%、93.1%~94.2%、93.7%~94.2%,推导的氨基酸同源性分别为88.3%~89.7%、89.7%~91.1%、96.2%~97.7%、97.7%~99.1%;6株广西CSFV流行毒株与国内外已发表的14株病毒相应序列进行比较,构建遗传进化树,结果表明所比较的20株毒株分为2个基因群,广西流行毒株均属于基因群Ⅱ。本研究成功地对广西流行猪瘟病毒株的E0基因进行了测序分析,表明近年来广西流行毒株未发生较大的变异,但病毒株有远离疫苗株发展的趋势。     

猪瘟病毒云南流行毒株E2基因遗传变异分析

为了解云南省猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)流行毒株E2基因的遗传变异情况,试验采用RT-PCR检测云南省疑似猪瘟阳性样品,并获取4株E2全基因序列。对所获的E2基因序列与国内外参考毒株进行同源性和遗传进化树比对分析。结果表明,获得4条全长均为1119bp的云南省CSFV流行毒株E2全基因序列。4株云南毒株序列的同源性为81.7%～99.6%,与疫苗毒株的同源性为81.3%～94.5%,与其他参考序列的同源性为81.8%～99.6%。遗传进化分析表明,4株云南流行毒株分为两个不同的进化分支,1株流行毒株和疫苗毒株同属于1.1基因亚型,其他3株流行毒株分布在另一进化分支上,属于2.1c基因亚型,研究结果为云南地区猪瘟的防控提供了一定的理论参考。     

规模化猪场脐带血猪瘟病原检测及遗传变异分析

为了了解某规模化猪场母猪猪瘟病毒(CSFV)带毒及病原遗传变异情况,应用荧光定量PCR对117份分娩母猪的脐带血进行猪瘟病原检测,对阳性样品进行CSFV E2基因RT-PCR扩增,研究CSFV遗传变异特性。结果表明,该猪场猪瘟病原阳性率为7.69%(9/117),5株CSFVE2基因之间的核苷酸同源性为97.8%~100%,与参考株的同源性为80.0%~97.5%,与C株和HCLV株的同源性分别为95.6%~96.7%、96.4%~97.5%;5株CSFVE2基因推导的氨基酸同源性为97.8%~100%,与参考株之间同源性为83.5%~96.7%,与C株和HCLV株同源性均为95.5%~96.7%。遗传进化树分析表明,5株CSFV E2基因属于1.1亚群,与疫苗株HCLV亲缘性最近;氨基酸变异位点分析表明,5株CSFV E2基因在位于抗原决定区内氨基酸发生较小程度的变异。表明该猪场通过胎盘屏障感染仔猪的猪瘟病毒可能来源疫苗株,这种现象应该引起重视。     

河北省猪瘟病毒分子流行病学调查

为了研究河北省猪瘟病毒(CSFV)遗传变异规律,试验采用RT-PCR方法对河北省CSFV流行毒株E2基因进行扩增并测序,分析其遗传变异。结果表明:河北省CSFV流行毒株分为基因Ⅰ群和基因Ⅱ群,没有检测出基因Ⅲ群毒株。检测到3个基因型,其中起源于欧洲的2.1亚型已成为河北省的主要流行毒株,中国1.1亚型的传统毒株仍然存在,而20世纪80—90年代的基因2.2亚型和2.3亚型很少,有消失的趋势。核苷酸和氨基酸序列同源性分析显示,E2蛋白抗原表位氨基酸位点已发生变异,且疫苗株HCLV1900和流行毒株同源性较低,可能导致疫苗不完全保护。     

广东省猪瘟流行野毒E2基因的扩增及其序列分析

运用RT-PCR技术对3株广东省近期流行的猪瘟野毒的E2基因进行了扩增,并进行核苷酸序列分析,同时与国内外参考毒株的抗原序列进行了比对分析,绘制系统发育进化树。结果表明,3株流行毒株E2基因间核苷酸序列的相似性为81.9%～90.9%,所推导氨基酸序列相似性为56.6%～77.4%;与石门株之间核苷酸序列的相似性为82.3%～93%,所推导氨基酸序列相似性为57%～84.5%。经系统发育关系分析,1株属于基因1群(group1),2株属于基因2群(group2),提示近期猪瘟流行毒株的变异呈现一定的多样性。     

2015年我国部分地区2.1d新基因亚型猪瘟病毒的分子流行病学分析

为了解猪瘟病毒(CSFV)在我国的流行情况,本研究对2015上半年来自4个省疑似猪瘟(CSF)病料样品采用RT-PCR方法进行检测,28份样品中14份为CSFV阳性,并对这些阳性样品进行CSFV E2基因遗传进化分析。结果表明,14个病毒株中11个属于2.1d新基因亚型,它们与CSFV代表株Shimen、HCLV和2.1b基因亚型病毒株的核苷酸同源性分别为82.8%~84.1%、81.1%~82.4%和92.6%~97.1%,氨基酸同源性分别为89.8%~91.2%、88.2%~89.8%和94.1%~98.9%,其余3个病毒株属于2.1b亚型。这些2.1d亚型新分离株在E2基因的4个氨基酸(R31、S34、K303和A331)上具有相同的分子特征。本研究结果与我们2014年CSFV流行病学研究结果一致,表明2.1d亚型病毒株已成为我国现阶段CSFV的主要流行株。     

2.1c亚群猪瘟病毒GXF29/2013株全基因组克隆测序及遗传进化分析

参考GenBank登录的2.1亚群猪瘟病毒(CSFV)的核苷酸序列,设计并合成4对引物,应用RT-PCR技术,扩增出了CSFV广西流行毒株GXF29/2013的全基因组,并进行核苷酸测序。结果 GXF29/2013株的全基因组长度为12 296个核苷酸。用MEGA5.0软件对GXF29/2013与GenBank上登录的20株不同亚型(1.1、2.1、2.2、2.3和3.4)CSFV参考株进行全基因组核苷酸序列及开放阅读框编码的氨基酸序列比较,发现GXF29/2013与参考株核苷酸序列同源性在83.2%~98.0%之间,氨基酸序列同源性在91.2%~98.8%之间。用E2基因进行系统发生树分析,结果表明GXF29/2013属于最近出现的2.1c亚群。对E2蛋白进行分析,结果表明GXF29/2013株有2.1c亚群毒株的特征,与2.1b毒株的遗传进化关系比与1.1亚群毒株的近。该毒株既保留了CSFV E2蛋白的一些关键特征,又与疫苗毒株的一些关键抗原位点不同。GXF29/2013病毒株全基因序列的获得为下一步进行CSFV反向遗传操作平台的建立奠定了基础。     

我国近期7株猪瘟流行野毒E2基因变异研究

应用RT PCR 和nPCR 扩增了7 株国内近期(2001 年-2003 年)流行的猪瘟野毒E2 基因,分别克隆至pGEM T 载体并对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与C 株、Alfort 株、Brecsia 株进行了同源性比较及遗传进化分析,构建了CS FV的遗传发生树,并对E2 结构与功能进行了分析。所测7株野毒均包括完整的信号肽序列及部分跨膜区在内的1 170 bp,与C株、Alfort株、Brescia 株核苷酸序列同源性分别为91.6%~94.5%、89.2%~92.7%、85.9%~89.3%,氨基酸同源性分别为91.2%~95.8%、88.9%~92.0%、84.0%~90.1%;而7株野毒之间的差异很小,其核苷酸序列同源性为95.8%~99.7%,氨基酸同源性为96.3%~99. 1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群,所测得7 株流行野毒均属于第1 群,而且可分为两亚群,与C 株在同一亚群。同时对主要抗原区氨基酸位点变异进行了分析,对其抗原决定簇的变异情况进行了推测。     

RHDVCD株VP60主要抗原表位基因的克隆与序列分析

本实验用RHDVCD株人工感染家兔,发病死亡后,取肝脏匀浆,用Trizol试剂从匀浆上清中提取病毒RNA。根据Genbank已发表序列保守区设计并合成引物,采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。PCR产物纯化后,进行序列测定。测序结果表明,VP60主要抗原表位基因长525bp。该序列与已发表的其它13株RHDVVP60同一核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行同源性比较。结果显示,CD株核酸序列与WX-84株同源性最高为97．5％,与其它毒株的同源性在92．0％～96．6％之间。氨基酸序列与WX-84株、墨西哥Mexi—co-89株同源性最高为99．4％,与其它毒株的同源性在96．6％N98-3％之间。     

4株猪圆环病毒2型凉山州分离株全基因组进化分析

为了解猪圆环病毒2型(PCV2)凉山州分离株的基因型,本研究采用PCR方法对采自凉山州3个发病猪场的4个PCV2阳性样品进行全基因组序列的扩增、克隆、测序分析,并绘制遗传进化树。结果显示:4个PCV2凉山州分离株全基因组序列长度均为1767 bp,核苷酸同源性为99.4%~99.8%,与国内外101株PCV2参考毒株核苷酸同源性为93.8%~99.9%,与4个PCV2国产疫苗株核苷酸同源性为95.1%~96.0%;4个分离株ORF1和ORF2基因核苷酸同源性分别为99.3%~99.8%和99.6%~100%;构建的系统进化树显示,4个分离株均为PCV2d亚型,与YA1株(四川雅安,MH094769)的亲缘关系最近。本研究为凉山州PCV2疫苗毒株的选择提供了科学依据。     

猪瘟病毒低毒力毒株FJFQ株的分离鉴定

从福建某猪场分离到 1 株病毒,其在PK 15细胞上的毒价为 106.5 TCID50/mL,该病毒能被猪瘟病毒高免血清所中和(效价为1∶8)。通过 RT -PCR 扩增出猪瘟病毒约250 bp的E2蛋白主要抗原编码区序列,其与几株已发表毒株序列的核苷酸及氨基酸同源性分别为79.9%~87.9%,77.7%~86.6%,与Alfort 株同属于基因二群。经本动物传3代均不表现明显的临床症状。用猪瘟兔化弱毒疫苗免疫后以此分离毒作强攻进行免疫保护相关实验,结果免疫组猪在攻毒前及攻毒后扁桃体 HCFA检测均为阴性,对照组猪扁桃体HCFA于攻毒后1周开始出现阳性结果,且一直持续到试验结束。用分离株免疫本动物后再攻石门毒, 2 头试验猪中 1 头死亡,1头出现临床症状。初步说明,所分离的病毒为猪瘟病毒(命名为CSFV- FJFQ株),可能是一株低毒力毒株,且其免疫原性不好。     

猪圆环病毒2型山西株全基因组序列分析

为了解山西省猪圆环病毒2型（PCV2）的遗传变异情况,本试验采用PCR方法对山西省分离的4株猪圆环病毒流行株（SXXZ1株、SXXZ2株、SXTY株和SXJZ株）的全基因组进行了扩增、克隆和测序,并将其全基因组序列与国内外34株主要流行毒株进行核苷酸同源性与系统进化树分析。结果显示,4株PCV2山西流行株全基因组核酸序列全长SXJZ株为1 768 bp,其余均为1 767 bp,分别占25%和75%。4株毒株核苷酸同源性为95.9%~100.0%,与国内外34株参考株同源性为94.5%~99.9%,与国产疫苗株同源性为95.6%~99.8%;PCV2全基因组序列进化分析表明,本研究分离的SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株属于PCV-2b基因型,SXJZ株属于PCV-2e基因型,其中SXXZ1株和SXXZ2株与广东QY株的进化关系最近,SXTY与奥地利AUT5株的进化关系最近,SXJZ与福建FJ株的进化关系最近;而SXXZ1株、SXXZ2株和SXTY株与山西PCV2疫苗DBN-SX07-2株的进化关系较近,SXJZ株与国内PCV2疫苗LG株的进化关系较近。从而证实在山西省流行的PCV2毒株以PCV-2b为主,同时还分离出了PCV-2e亚型,表明山西省存在PCV-2e亚型毒株。本试验结果为山西省PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。     

Genome Sequence Analysis of Porcine Circovirus Type 2 Strains from Shanxi Province

In order to study genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains in Shanxi province, the genomic sequences of four PCV2 strains which were SXXZ1, SXXZ2, SXTY and SXJZ were isolated recently from some areas of Shanxi province, they were amplified, cloned and sequenced. The amplified PCV2 genomic sequences of these four strains were analyzed and compared with that of 34 published PCV2 stains by DNAStar and drawing phylogenetic tree. The results showed that the genomic sequences of SXJZ PCV2 strain was 1 768 bp, and the others were 1 767 bp, which accounted for 25% and 75%, respectively. The homologies of nucleotide sequences of the four strains were 95.9% to 100.0%, the homologies of nucleotide sequences of the four strains with the 34 isolates from different regions of the world PCV strain were 94.5% to 99.9%, and the homologies of nucleotide sequences of the four strains with the domestic vaccine strains were 95.6% to 99.8%. The phylogenetic tree analysis showed that SXXZ1, SXXZ2 and SXTY belonged to PCV-2b genotype, and SXJZ belonged to PCV-2e genotype. The evolutionary relationship among SXXZ1, SXXZ2 and the QY strain of Guangdong were closer, we also found a recent evolutionary relationship between SXTY and AUT5 of Austria, and a recent evolutionary relationship between SXJZ and FJ of Fujian. Besides the evolutionary relationship among SXXZ1, SXXZ2, SXTY and the DBN-SX07-2 of PCV2 vaccine of Shanxi province, a recent evolutionary relationship between SXJZ and LG of PCV2 vaccine were found. Thus PCV2 strains were popular based on PCV-2b in Shanxi province, also PCV-2e was isolated and existed. It laid a foundation for the molecular epidemiology, genetic variation, prevention and control of PCV2 in Shanxi province.     

我国近期猪瘟分子流行病学动态

利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)及测序技术 ,测定 2 0 0 2年分离于我国甘肃、湖南、海南、青海等省的 9株猪瘟野毒的E2基因序列 ,并与C 株疫苗毒进行同源性比较 ,绘制CSFV系统发生树。结果表明 ,近期分离于我国的 9株野毒与C 株核苷酸序列间的同源性在80 .7%～ 99.1 %,氨基酸同源性在 89.3%～98.9%。9株野毒分属于 2个不同的组群 ,其中 5株与我国经典的石门强毒和C 株疫苗毒同属于Subgroups1 .1 ,另 4株属于与C 株有较大差异的Subgroup2 .1。     

猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析

采用PCR方法对2011-2013年山西省分离的2株猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）的胸苷激酶（TK）基因进行了克隆和测序,并将其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外主要流行毒株Bartha株、Becker株、Ea株、Kaplan株、LA株、Min-A株、NIA-3株、SH株、SL株和Yangsan株进行了同源性分析。序列分析结果表明,核苷酸同源性分别为99.7%、99.6%、99.8%、99.7%、99.7%、94.4%、99.1%、57.2%、99.5%、99.7%;氨基酸同源性分别为99.1%、99.1%、99.7%、99.4%、99.4%、90.3%、98.1%、49.7%、98.8%、99.1%。另外在核苷酸序列中起始密码子上游有3段GC box的序列,终止密码子下游有多聚腺苷加尾信号AATAAA;TK基因均由320个氨基酸组成,氨基酸序列中有疱疹病毒TK基因共同的保守序列-R*Y*DG**G*GK*T-和-FDRHP*A***C*P*AR-。