表达PLRV CP基因的转基因马铃薯抗病性田间鉴定

以表达马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因的转基因马铃薯为供试材料，在接种病毒后续发感染条件下观察鉴定转基因株系的田间发病率，发病时间和发病指数．结果表明转基因马铃薯株系延迟发病时间、降低发病百分率和发病指数．     

病毒外壳蛋白基因在马铃薯基因组中的整合与转录表达

以表达马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的转基因马铃薯植株为供试材料,在接种病毒后续发感染条件下提取转基因植株ＤＮＡ和ＲＮＡ,用克隆的病毒ＣＰ基因ｃＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,结果表明,外源ＣＰ基因稳定整合于马铃薯基因组内,并在转录水平上高效表达．     

冬种马铃薯卷叶病田间调查及RT-PCR检测技术研究

对惠州市冬种马铃薯卷叶病发病情况进行调查研究,建立了马铃薯卷叶病毒(PLRV)RT-PCR检测技术。结果表明,马铃薯卷叶病发病率为3.0%～29.7%。比较LiCl、异硫氰酸胍和试剂盒3种方法提取马铃薯卷叶病毒总RNA,以异硫氰酸胍和试剂盒提取效果较好,LiCl次之;根据卷叶病毒外壳蛋白基因序列设计引物,从感染马铃薯卷叶病毒的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,合成cDNA并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约336bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而健康叶片RNA扩增未得到任何产物。应用RT-PCR技术对马铃薯试管苗和种薯进行了卷叶病毒检测。     

RNA干涉转基因马铃薯对卷叶病毒抗性的研究

利用大田统计方法,结合分子生物学手段和生物信息学手段对转化的23个转基因马铃薯突变株进行抗病性鉴定,分析转化群体中外源基因的插入信息,并利用双夹心抗体酶联免疫法技术研究受侵染后马铃薯卷叶病毒基因在这些转化体中的表达情况。结果表明,一些株系出现了性状突变,通过分子生物手段检测发现大部分株系都有一定的马铃薯卷叶病毒抗性,但是抗性水平差异很大。试验验证了RNA干涉技术策略的可行性。     

陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测与序列分析

以陕北8个县(区)种植2~3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料,用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA,以已公布的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(CP)基因序列设计特异引物,通过RT-PCR扩增目的DNA片段,对CP基因进行克隆和测序,采用DNAstar软件分析序列的一致性。结果表明,从陕北8个县(区)马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致、长度为336 bp的目的片段,说明马铃薯均感染了卷叶病毒。陕北8个县(区)马铃薯卷叶病毒CP基因之间的序列一致性达99.6%以上,与国内外其他地区10个样品CP基因的序列一致性为96.2%~99.8%,表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守。     

马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物。从感染马铃薯卷叶病毒(PLRV)的马铃薯叶片中提取出病毒RNA,进行cDNA合成并运用RT-PCR技术进行体外扩增,得到一条长度约627bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致,而对照未得到任何产物。从而建立了快速灵敏的PLRV检测方法,为PLRV的防治及检测提供了有效手段。     

PLRV 56KD蛋白基因植物转化载体的构建

为培育转基因抗马铃薯卷叶病毒的新材料 ,采用二次连接法将存在于克隆载体 p L R5 6中的马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码区构建到双元载体系统的中间表达载体质粒p ROK 中 ,采用三亲融合法和直接导入法转化根癌农杆菌 LBA4 40 4 ,PCR法检测。实验表明 ,二次连接法效果优于一次连接法 ,两种连接法对比 ,二次连接法更适用于大分子质粒的重组。直接导入法比三亲融合法更简便 ,二者转化效率没有显著差异。实验构建完成马铃薯卷叶病毒 5 6 KD蛋白基因及 3 端非编码植物转化载体 ,建立了高效、简便的植物转化载体的构建方法     

陕西马铃薯卷叶病病原的分子生物学鉴定

【目的】对陕西榆林疑似感染马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的病株毒源进行分子生物学鉴定,为陕西省马铃薯卷叶病的防治提供参考。【方法】根据GenBank数据库已报道的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)基因序列设计了1对引物,利用RT-PCR技术成功扩增了陕西PLRV.CP基因,然后进行克隆、测序,并与GenBank中已报道的27个PLRV分离物的CP基因进行同源性分析。【结果】获得的陕西PLRV.CP基因大小为627 bp,含有1个ORF,编码208个氨基酸的多肽,其与已报道的27个国内外PLRV.CP高度同源。【结论】陕西榆林的疑似病株确定为感染PLRV的马铃薯病株。     

PLO介导PLRV-CP基因转化马铃薯获转基因抗性植株

利用PLO(Poly-L-Ornithine)将外源PLRV-CP基因导入到马铃薯加工型品种大西洋原生质体中,获得了转化后代,经过PCR和RT-PCR分析均显阳性,蚜虫接种PLRV,结果比对照明显抗PLRV。     

桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗体的制备及利用

对桑花叶卷叶病相关病毒外壳蛋白抗原性较好的核心结构域进行克隆和序列多样性分析,结果表明50个克隆中有19个克隆株,CP16为优势株。构建重组表达载体pET-28a-SUMO-CP16,成功在大肠杆菌Rosetta中诱导表达该蛋白,利用亲和层析纯化重组蛋白并制备多克隆抗体。经Western杂交和ID-ELISA检测合格的抗体偶联Tosylactivated磁珠,用于桑花叶卷叶病相关病毒的纯化。经qPCR技术检测显示,纯化后的病毒样本中的背景RNA得到极大的减少,获得了高纯度的病毒样品。     

用小RNA深度测序鉴定广西冬种马铃薯病毒

【目的】对广西冬种马铃薯病毒进行鉴定,为无病毒种薯选择和大田防治提供依据。【方法】2012年在马铃薯主要产区采集具有明显病毒病症状的样品,在血清学ELISA检测的基础上,进一步用小RNA深度测序对按症状分类的样品进行混合样本的病毒种类鉴定,再用RT-PCR方法对分组混合样本进行验证。【结果】在109个样本中检测到马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯H病毒（Potato virus H,PVH）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）和马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）,同时发现PVS有丰富的株系分化。【结论】近年广西冬种马铃薯病毒种类增多,病症多样,亟需加强种薯管理,培育无毒健康种薯。     

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

马铃薯抗卷叶病毒基因工程研究现状

综述了马铃薯抗卷叶病毒基因工程的研究进展。在抗马铃薯卷叶病毒基因工程研究中,主要采用RNA干涉、转抗马铃薯卷叶病毒基因、核酶剪切基因组、基因定点突变等方法获得抗马铃薯卷叶病毒植株,已经取得突破性进展。通过对抗病基因工程策略及取得的成效进行概括总结,旨在为抗马铃薯卷叶病毒育种工作提供借鉴。     

云南马铃薯A病毒分布及其外壳蛋白分子变异分析

为研究云南马铃薯A病毒(PVA)分布及其外壳蛋白的分子变异,2007年至2011年分别从云南滇西北、滇东北、滇中及滇南马铃薯种植区采集381份马铃薯样品,进行马铃薯A病毒DAS-ELISA检测,结果表明,PVA阳性样品共43份,其中滇西北22份,滇中17份,滇东北4份,滇南未检出。对带有PVA的部分样品进行电镜负染色观察,电镜下观察到长约750 nm、直径约15 nm的线状粒子。根据已报道的PVA外壳蛋白基因(cp基因)序列设计合成特异性引物,以带毒样品总RNA为模板,RT-PCR扩增得到807 bp目的片段,克隆测序并对其推导的外壳蛋白(CP)氨基酸序列进行同源性分析,并比较分析了不同地区PVA分离物CP氨基酸序列分子变异。结果表明,云南不同地区PVA分离物与GenBank中登录的部分PVA分离物CP氨基酸序列同源性为93.3%～100%,依据不同PVA分离物CP氨基酸序列构建系统进化树,云南PVA分离物与中国福建分离物(AF483279)亲缘关系较近,形成一个进化簇。PVA不同分离物CP氨基酸序列分子变异分析表明,不同分离物CP氨基酸变异位点主要分布在氨基酸序列的N端。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

Risk Assessment of Synergism and Recombination on the Transgenic Plants Containing Viral Movement Protein and Replicase Genes

The transgenic tobacco plants transformed with movement protein gene of Tomato mosaic virus (ToMV) or Tobacco mosaic virus (TMV) and partial replicase gene of Cucumber mosaic virus (CMV) P1 isolate (CMV-P1), were inoculated with Potato virus X, Potato virus Y, TMV and CMV isolate RB (CMVRB), respectively. Symptom observation showed there were no symptom differences in transgenic tobacco plants as compared with those in non-transgenic tobacco plants. ELISA also illustrated that the virus concentrations in the transgenic plants were similar to those in non-transgenic plants, indicating that no synergism is found in these plants. The transgenic tobacco plants expressing movement protein gene of ToMV or partial replicase gene of CMV-P1 were inoculated with TMV and CMV-RB, respectively. The local or systemic infected leaves were then used for elucidation of the possible virus recombination in transgenic plants with biological infectivity test, ELISA and immuno-capture RT-PCR. Within 16 months, no recombination was found between transformed genes and inoculated virus genomes. The research provides fundamental data for understanding of the possible risk of the transgenic plants expressing viral sequences.     

应用 RT-PCR 法快速检测马铃薯卷叶病毒

根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染ＰＬＲＶ的马铃薯病叶组织中提取出病毒的ＲＮＡ,进行ｃＤＮＡ合成及ＰＣＲ扩增,得到一条长度约６２０ｂｐ的特异ＰＣＲ扩增产物,与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的ＰＬＲＶ检测的新方法,其灵敏度要比ＰＬＲＶ的血清学检测方法高１０＾４倍,在基因水平上为ＰＬＲＶ的检测提供了更新手段,并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检