纳米磁珠联合PCR检测甘蔗杆状病毒方法的建立和初步应用

本研究通过对DNA提取裂解液的成分和用量以及裂解时间等因素进行系统优化,建立了一种高通量的磁珠法提取甘蔗总DNA,再进行PCR检测甘蔗杆状病毒(SCBV)的方法。采用核酸自动提取仪,应用纳米磁珠提取甘蔗总DNA,经PCR检测甘蔗杆状病毒,并与以试剂盒提取DNA为模板的PCR检测结果进行比较。结果显示,经优化的裂解液成分为EDTA·Na20.08 mol/L、NaCl 0.8 mol/L、SDS 2%和Tris-HCl0.10 mol/L,裂解时间为20 min,可用于纳米磁珠提取甘蔗总DNA进行SCBV检测。所建立的方法通量高、成本低、耗时短,可用于SCBV的批量检测。     

引进甘蔗种质资源杂交后代适应性评价

通过对引进甘蔗种质资源24个杂交后代的的10个农艺性状进行主成分分析、回归分析与通径分析,科学评价引种甘蔗种质资源在广西本地的农艺性状表现,探究各农艺性状间的协同制约关系,为甘蔗种质资源的精准评价和杂交育种材料的科学选配提供理论依据。结果表明:(1)主要农艺性状变异系数为6.79%~29.44%,24个甘蔗种质在分蘖和蔗糖产量上有较大的遗传改良潜力。(2)主成分分析将这10个农艺性状凝聚成4个主成分,分别为产量因子、有效茎因子、糖分因子和出苗因子,贡献率分别是35.2%、16.5%、15.3%、12.1%,累计贡献率达到79.1%;(3)通径分析中各性状对糖产量的直接通径系数大小依次为:蔗茎产量(0.927)>蔗糖分(0.399)>单茎重(0.039)。表明:甘蔗品种(系)GUC23-1、GUC15-2、GUC23、GUC34、GUC25在广西的丰产性最优,在甘蔗引种和选育中,考虑将蔗茎产量、蔗糖分、单茎重作为主要选择性状。     

宿根矮化病菌对甘蔗品质及茎、叶超微结构的影响

 甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease, RSD)是由Leifsonia xyli subsp.xyli (Lxx)引起的,是目前世界所有植蔗地区危害性极大的病害之一。本实验以甘蔗品种新台糖22号(ROC22)健康植株为对照,感染RSD植株为处理,观察和测定RSD侵染甘蔗引起的蔗株农艺性状、蔗糖分以及茎、叶超微结构的变化。结果表明:(1)感染RSD种茎的出苗率比对照减少2.94个百分点;株高比对照下降28.85 cm;茎径比对照减少0.28 cm;节间长度比对照减短3.50 cm;单茎重比对照低0.36 kg。(2)感染RSD植株的蔗糖分低于对照0.9个百分点(绝对值)。(3)利用透射电镜技术对感染RSD植株茎、叶细胞超微结构进行观察表明,叶片叶肉细胞、维管束鞘细胞及茎细胞内的细胞器及细胞核都发生了明显的病理变化。与健康叶片相比,叶绿体变形,叶绿体基质片层大部分消解,基粒结构消失,叶绿体外膜和内膜剥离。线粒体形态异常,有的肿大、内嵴模糊,严重者内嵴消失并空泡化,仅剩未被消解的残骸;细胞核形态变为不规则,核膜破裂,染色质分布不均匀,呈降解状态。在感染RSD甘蔗茎维管束导管细胞内积累有大量的电子致密物质,细胞壁有不同程度的溶解和断裂,这可能和RSD病原细菌侵染有关。以上结果表明:RSD侵染甘蔗后,可能导致光合效率下降,对水分和营养物质的运输能力降低,从而导致甘蔗品质和产量的降低。     

番茄中一个LSm1蛋白同源基因LeLSm1的克隆及表达分析

从番茄品种超级大明星中克隆LSm1蛋白同源基因LeLSm1。LeLSm1基因全长cDNA共有1 038个核苷酸,包含一个387个核苷酸的编码区,以及318个核苷酸的5′非编码区和333个核苷酸的3′非编码区,编码一个含128个氨基酸的蛋白质,分子质量为14.5 ku,等电点为4.94。LeLSm1编码的氨基酸序列包含LSm1蛋白的保守功能域,与截形苜蓿、拟南芥和水稻等植物的类似LSm蛋白具有高度的同源性,在氨基酸水平上的一致性依次为82.8%、82.0%和72.1%。用PCR方法克隆了LeLSm1基因,其全长转录区共4 751 bp,其中包含5个外显子和4个内含子。Southern杂交结果显示,LeLSm1是单拷贝基因。半定量RT-PCR分析表明,LeLSm1在番茄五叶期和结果期的根、茎、叶以及花和果实中均有表达,且表达量无明显差异,是一个组成型表达基因。     

广西斜纹夜蛾核型多角体病毒的分离鉴定

从广西部分地区采集到自然罹病死亡的疑似具有病毒症状的斜纹夜蛾幼虫，对其进行病毒的分离鉴定。用研磨病虫尸体得到的浆液，经分离纯化后感染连续人工饲养至第三代的健康斜纹夜蛾三龄幼虫，部分样品能诱发病毒病症状。经差速离心的提纯物，在相差显微镜下观察到外形不规则的颗粒，进一步在电镜下观察到菱形、五边型、六边形、近似圆形等形状的多角体。用依据SpltNFV DNA的egt基因保守序列设计的引物，对多角体中提取的DNA进行PCR扩增，得到了与预期一致的380bp片段。经测序分析，该PCR片段与Splt NPV egt基因在核苷酸水平上的同源性为99．4％，演绎的氨基酸水平上的同源性为100％。进一步对采自广西16个地域的疑似具有病毒症状的200份斜纹夜蛾幼虫样本进行PCR扩增，其中6个地域的62份样本呈PCR阳性，这表明，广西斜纹夜蛾自然种群中存在着SpltNPV的流行。     

桑脉带相关病毒N蛋白多克隆抗体的制备

 桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的新成员,是广西桑树病毒病的主要病原病毒。本研究将MVBaV核外壳蛋白(nucleocapsid protein, N protein)基因连接到pET-30a原核表达载体上,获得重组表达载体pET-30a-MVBaV-N并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导可表达产生一个含His标签、分子量约36.0 kDa的融合蛋白。用 Ni^{2 +} -NTA树脂纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔制备多克隆抗体。间接ELISA测定抗体的效价为1∶256 000。Western blot 检测结果显示,该多克隆抗体在稀释倍数1∶1 000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,但不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。将抗体按1∶2 500稀释后进行间接ELISA,可有效检出桑叶中的MVBaV。MVBaV N蛋白抗体的成功研制,为桑脉带病毒病的诊断及MVBaV与寄主相互作用机制的研究提供了重要的试剂。     

罗汉果种子传播小西葫芦黄化花叶病毒的检测

为了解小西葫芦黄化花叶病毒（Zucchini yellow mosaicvirus,ZYMV）是否能通过罗汉果种子传播。本研究通过取ZYMV阳性的罹病罗汉果植株种子700粒,400粒直接播种于防虫网室中,300粒经表面消毒处理后播种于MS培养基上。最终获得213棵罗汉果实生苗。对所获得实生苗进行生物学鉴定及ZYMV特异性RT-PCR检测,均未检测到ZYMV阳性植株。结果表明ZYMV不能经罗汉果种子传播,或其传播率很低。     

甘蔗DELLA蛋白GAI基因的蛋白表达及纯化

赤霉素是开花植物生长发育过程中一个重要的激素,调控种子萌发、茎伸长、叶片扩张、花器官发育,参与各种生物胁迫等多种途径;DELLA蛋白是赤霉素信号途径的抑制因子,DELLA蛋白通过与其他蛋白互作进行相关调控。为研究甘蔗蛋白调控机制,本研究利用原核表达技术体外诱导进行表达。结果表明,ScGAI蛋白全长不表达,但ScGAI-C在pET-28a(+MBP)中能够有效表达,大量诱导蛋白表达后经镍柱纯化,Western blot分析验证ScGAI蛋白被成功诱导出来。     

广西南宁市木薯褐斑病的发生调查及其病原鉴定

经2009年7~11月对南宁市武鸣县太平镇、宁武镇等地的木薯褐斑病进行调查,发现木薯褐斑病在南宁市各木薯种植区普遍发生,9、10、11月病害发生较重,最高病叶率达50.7%,病情指数为14.1;通过柯赫氏法则验证、病原菌的形态特征观察及其rDNA-ITS序列测定,鉴定出引起木薯褐斑病的病原菌为木薯钉孢[Passalora henningsii (Allesch.) R.F.Castaneda U. Braun]。     

小西葫芦黄化花叶病毒罗汉果分离株抗血清的制备和应用

将分离自罗汉果(Siraitia grosvenorii)的小西葫芦黄化花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV-LHG)在西葫芦上繁殖,利用差速离心法与PEG沉淀法相结合提纯病毒粒子,用于免疫新西兰大白兔,成功制备出效价为1∶10 240的抗血清。分别用健康西葫芦叶片总蛋白及健康西葫芦叶片汁液吸附处理抗血清,比较2种处理后抗血清背景反应,以健康西葫芦汁液吸附法较佳。用间接ELISA对罗汉果果园及附近共46个科114种植物进行检测,其中9个科25种植物有阳性反应,以葫芦科、苋科、豆科、锦葵科等阳性率较高。田间病毒病发病率调查表明,宿根苗发病率比组培苗高,发病时间更早,是田间罗汉果病毒病的主要初侵染来源之一。