葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

我国马铃薯抗病毒基因工程研究进展

10年来我国已合成克隆了PVX、PVY、PLRV的外壳蛋白基因 ,复制酶基因 ,蛋白酶基因 ,基因调控序列 ,核酶cDNA及其他各种基因并进行了序列分析。建立了完善的致瘤农杆菌介导的马铃薯转化技术。通过外壳蛋白基因介导 ,复制酶基因介导 ,表达基因调控序列和核酶等基因工程途径 ,获得了一批不同程度上抗PVX、PVY、PVX和PVY ,PVY和PLRV ,PLRY及高抗PSTVd的转基因马铃薯栽培种。这些转基因马铃薯多数已进入田间试验。不久一批抗病毒的优质高产的马铃薯栽培种 ,经过进一步发育 ,必将在生产中推广应用。抗病毒转基因马铃薯培育成功 ,为我国马铃薯病毒病害防治开辟了一条崭新的途径 ,也必将有力地促进我国马铃薯生产的发展     

病毒外壳蛋白基因在马铃薯基因组中的整合与转录表达

以表达马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的转基因马铃薯植株为供试材料,在接种病毒后续发感染条件下提取转基因植株ＤＮＡ和ＲＮＡ,用克隆的病毒ＣＰ基因ｃＤＮＡ为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析,结果表明,外源ＣＰ基因稳定整合于马铃薯基因组内,并在转录水平上高效表达．     

二价核酶基因构建及对PLRV负链靶序列的体外切割研究

根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)中国分离株(PLRV-Ch)复制酶基因负链RNA的二价核酶序列。将该核酶基因克隆到pGEM-4Z中,构建成体外转录载体pGEM-4ZDR;同时将包含核酶切割识别位点的PLRV-Ch复制酶基因cDNA近5’端的874 bp片段反向插入到pGEM-4Z中,构建了体外转录载体pGEM-4ZR5。以线性化的重组质粒pGEM-4ZDR和pGEM-4ZR5为模板,在T7 RNA聚合酶的作用下,分别转录获得核酶RNA和PLRV-Ch复制酶基因5’端负链RNA底物片段。将以上2种RNA转录物混合并经37℃保温后,检测结果表明,所得核酶RNA对PLRV-Ch复制酶基因负链RNA在体外具有较强的特异切割活性。     

苜蓿花叶病毒复制酶(P2亚基)基因3''''端cDNA植物表达载体的构建

将克隆的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlMV—Ch)复制酶(R亚基)基因3’端约1／2序列及其3’端非编码区(1234bp)cDNA重组于植物表达载体pROKⅡ中，构建了其正链RNA的表达载体pAMR3T，为进一步开展转基因研究创造条件。     

转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究

 用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。     

表达葡萄糖氧化酶基因抗晚疫病马铃薯的培育

葡萄糖氧化酶催化分子氧氧化b-D葡萄糖产生葡萄糖酸和H2O2。产生H2O2和其它活性氧物质是植物对病原体侵入的防御反应。实验证明H2O2水平升高不仅可诱发细胞过敏坏死反应，而且还能激活抗病基因表达如植物抗毒素及诱导病原相关蛋白（PR）等基因的表达。通过农杆菌介导将来自黑麴霉（Aspergillus niger)的葡萄糖氧化酶基因转入2个马铃薯重要栽培品种大西洋（Atlantic)和夏普蒂（Shepody)中获得23个转基因株系，其中75％为Kan抗性植株。在23个转基因株系中有16个株系可用PCR扩增出目的基因。进一步用核酸斑点杂交选出13个杂交阳性株系。转基因植物总DNA的Southem blot分析表明，GO基因已整合到马铃薯四倍体基因组中，转基因大西洋植株中目的基因为2－4个拷贝，而夏普蒂转基因植株中为1个拷贝。将转基因植株离体叶妆种呼和浩特地区流行的Phytophthoro infestans的复合生理小种1，3，4孢子。结果表明，和未转基因对照组相比转基因植株病斑出现时间晚，病斑扩展速度慢，发病程度轻，感病叶片少。总体上表现出较明显抗病性。转基因大西洋中抗性株系多于夏普蒂。转基因马铃薯植株体内H2O2含量测定表明，转基因马铃薯植株的根系和叶片在KI－淀粉培养基上数天后变为蓝色，而未转基因对照植株的根系和叶片变化不明显。试验表明，转基因马铃薯植株对晚疫病的抗性和体风H2O2含量水平呈正相关。还对马铃薯转化中再生小植株诱导，转基因植株中GO基因拷贝数，对晚疫病抗性的鉴定以及表达葡萄糖氧化酶基因的转基因马铃薯产生抗性的机理等问题进行了讨论。     

柳毒蛾核型多角体病毒毒力衰减测定

以天然饲料室内饲养的３龄柳毒蛾ＳｔｉｌｐｎｏｔｉａＳａｌｉｃｉｓ幼虫为供试虫，测定用同一标准方法生产的柳毒蛾核型多角体病毒杀虫剂的毒力。以当年生产的病毒杀虫剂为标准试剂，感染幼虫死亡率为９４％、ＬＣ５０为３．１５×１０３ＰＩＢ／ｍｌ。４℃条件下贮藏１年、２年、３年的病毒杀虫剂，其活性分别丧失１．９％、３．３％、７．９％。     

农杆菌素MI15的分离、纯化及分子量测定

放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)MI15菌株.属于生物Ⅰ型.在平皿培养时,能够产生农杆菌素MI15,能抑制葡萄根癌土壤杆菌的生长.采用透析和DEAE纤维素柱离子交换层析纯化制备了MI15菌株分泌的农杆菌素MI15.经HPLC分析,此制备物纯度较高,可达到结构分析要求.紫外吸收光谱分析显示,该物质在260nm和280nm处均无洗脱峰,故认为该物质不是核酸、蛋白类似物.经红外吸收和元素分析,初步认定它是一种小分子有机物,质谱测定结果显示,农杆菌素MI15的分子量为368.