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为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗M蛋白单克隆抗体(MAb),本研究以截短表达的His-M重组蛋白免疫BALB/c小鼠;以截短表达的GST-M重组蛋白作为包被抗原,采用常规的淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA进行筛选,得到一株稳定分泌抗M蛋白MAb.MAb亚类鉴定为IgG2b型,轻链为к链,杂交瘤细胞培养上清和诱导的小鼠腹水抗体效价分别为1:3000和1:2×105.Western blot试验表明该MAb能够识别重组及天然的PEDV M蛋白.间接免疫荧光试验表明该MAb能够与PEDV感染的Vero E6细胞产生特异性免疫荧光. 相似文献
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利用全长cDNA构建感染性克隆是拯救RNA病毒的基础和关键,也是反向遗传技术的核心。文章综述了构建正链RNA病毒感染性克隆的基本思路和关键技术,总结了影响克隆感染性的因素,并对感染性克隆技术的应用做一简述。 相似文献
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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由尼多目(Nidovirales)、冠状病毒科(Comnaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)α-冠状病毒中的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度传染性的肠道疾病,该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征。各种日龄的猪均易感,尤其是哺育仔猪,发病率高达100%,死亡率为30%~80%。 相似文献
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为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×101~3.31×107拷贝·μL-1模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×101拷贝·μL-1,组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为106.7、105.3拷贝·mL-1。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。 相似文献
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冠状病毒属于尼多病毒目(Nidovirales),冠状病毒科(Coronaviridae),冠状病毒属(Coronavirus)成员,为单股正链RNA病毒,根据其基因组和抗原性的特征又分为3个群:第1群主要包括猪传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)和人冠状病毒229E(Humancoronavirus 229E,HcoV-229E);第Ⅱ a群主要有小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV),第Ⅱ b群主要有严重的急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory synd-rome coronavirus,SARS-CoY);第Ⅲ群主要包括鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,my)、人冠状病毒0C43(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)[1,2]. 相似文献
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本研究以纯化的原核表达的猪轮状病毒VP7抗原表位区域为抗原,建立了检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA诊断方法。特异性试验表明,该抗原与其他7种常见猪病病毒(TGEV、PEDV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV、PrV)的阳性血清不发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;对来自不同猪场的血清的检测结果表明,该ELISA方法与中和试验检测结果符合率达94.8%。本试验建立的ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PRV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和轮状病毒流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。 相似文献
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为鉴定猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)NSP8蛋白的抗原表位,本研究对GST-NSP8重组蛋白进行了原核表达,并用纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏,采用常规杂交瘤细胞融合方法,经3次亚克隆后制备了1株稳定分泌抗NSP8蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。分泌的单克隆抗体亚类鉴定其重链为IgG1型,轻链为κ链;杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200。Western blotting试验结果表明该单克隆抗体能识别原核及真核表达的NSP8重组蛋白。利用截短表达的方法对NSP8蛋白进行抗原表位的鉴定,初步确定了单克隆抗体针对的抗原表位序列为31SPQILKQLTKAFNIAKSDFEREASV55。本研究制备的单克隆抗体及对抗原表位的鉴定,为TGEV NSP8蛋白相关功能的研究奠定了基础。 相似文献
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为确定猪捷申病毒(Porcine Teschovirus,PTV)Swine/CH/IMH/03株免疫原性,本研究将该PTV分离株灭活后分别与氢氧化铝佐剂和Montanide ISA 50V2佐剂混合,制成油佐剂疫苗,并采用不同免疫程序接种实验猪后对病毒抗体进行检测。抗体检测结果表明:PTV Swine/CH/IMH/03分离株能够诱导实验动物产生较高抗体水平,并显著高于对照组;与氢氧化铝佐剂混合制成的佐剂疫苗免疫效果优于Montanide ISA 50V2佐剂;而且一次免疫组与二次免疫组没有明显差异。通过PTV Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究,为后续猪捷申病的预防工作提供技术支持。 相似文献
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为确定猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株的易感细胞系及其致病性,本实验将该病毒接种不同细胞,通过细胞病变、电子显微镜观察和PCR技术进行鉴定。并进一步将该病毒回归本动物鉴定其致病性。试验结果表明,PTV Swine/CH/IMH/03对IB-RS-2和PK-15细胞系敏感,能够在IB-RS-2和PK-15细胞系中增殖。致病性试验结果显示,Swine/CH/IMH/03分离株能够导致实验猪出现神经症状,剖检可见脑、肾、脾、肠道发生出血,病理组织学检查可见脑实质内胶质细胞浸润、肾脏间质小血管淤血、脾淋巴细胞减少、小肠伴有出血及淋巴细胞浸润等病理变化,对仔猪具有强致病性。 相似文献