动物冠状病毒通用PCR方法的建立及基因序列分析

参考GenBank中公布的冠状病毒相关序列,根据动物冠状病毒聚合酶基因的保守区段设计一对通用引物。用这对引物对犬冠状病毒、猫冠状病毒等8种动物冠状病毒的cDNA模板进行通用PCR扩增和通用PCR反应条件的优化,结果均得到与试验设计相符的449 bp条带;特异性试验结果表明犬冠状病毒、猫冠状病毒等均扩增出449 bp目的条带,而阴性对照没有。敏感性试验结果表明,其敏感程度与常规PCR方法相同。将扩增的聚合酶基因与冠状病毒的参考毒株进行同源性比对,同源率在56.69%～99.55%之间。进化树分析结果与文献中对冠状病毒根据血清学与基因学角度分类报道相一致。     

金丝桃素注射液质量标准的研究

金丝桃素（hypericin，4.4，5，5，7，7一六羟基一2，2一二甲基一中位一萘并二蒽酮）是贯叶连翘Hypericum perforatum L．中最具有生物活性的物质，具有抗抑郁、镇静、抗菌消炎、光敏活性，尤其是抗病毒作用突出。研究表明，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所从贯叶连翘中提取分离并合成的金丝桃素络合物，具有很强的杀菌和抗病毒作用。笔者等对金丝桃素注射液制备工艺进行了比较。从中选择一种最佳制备工艺，并按照中国药典要求对其质量标准进行了研究。以便将金丝桃素注射液进一步推广应用。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段的表达、纯化及抗原性分析

根据已克隆的戊型肝炎病毒株swCH189株结构蛋白基因（ORF2）的抗原性及水溶性分析,在其序列上设计套式引物,采用RT-PCR技术扩增猪戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白基因ORF2主要抗原基因片段,长度为728bp,将其克隆于PMD18-T载体,测序结果表明插入的片段属于猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因ORF2部分;将该片段插入pet32a表达载体,经酶切、测序鉴定证实获得了带有目的基因的重组表达质粒。将重组质粒转化Rosetta菌,经0.3mmol/L IPTG诱导得到融合表达,得到相对分子质量为45 000的重组蛋白,以包涵体形式存在。Western blot分析表明,该蛋白可以与猪戊型肝炎阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。并用SDS电泳切胶纯化和透析浓缩方法进行纯化,用纯化的蛋白免疫兔子,经每2周免疫1次,连续3次免疫后,对免疫组和对照组,分别在45,60,90d采血,每只兔子采集1份。用夹心ELISA法测定免疫血清抗体,结果表明免疫组在45d后均产生具有HEV抗原结合活性的抗体。本试验对猪swCH189株CP239基因的克隆和表达研究,为进一步研究结构蛋白基因ORF2的生物学功能奠定了基础。     

多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒

根据Genbank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计并合成引物,对样品中PRVDNA进行多重PCR扩增及反应条件优化,得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为427bp（gB）、298bp（gE）和208bp（TK）。用这3对引物对四种伪狂犬疫苗样品DNA进行多次多重PCR扩增,其中1种疫苗得到与设计相符的1条特异性条带,其余为2条。该结果表明,此检测方法敏感度较高,适用于科学研究、临床诊断以及流行病学调查,对根除伪狂犬病具有重要意义。     

人源肺细胞cDNA文库构建及与流感病毒NP互作宿主蛋白的筛选

【目的】构建肺组织细胞Calu-3及A549的高质量酵母cDNA文库并筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主因子,为深入研究流感病毒NP蛋白功能、病毒复制及致病机制奠定基础。【方法】提取等量Calu-3及A549细胞的总RNA,混合后反转录生成cDNA,利用长距离PCR(LD-PCR)扩增合成dscDNA,用CHROMA SPINTM+TE-400纯化柱纯化dsDNA,按照Clontech公司的Make Your Own"MatePlate"Library System操作程序,将带有同源臂的dscDNA与线性化p GADT7-Rec共同转化Y187酵母感受态细胞,涂布SD/-Leu平板后于30℃培养4d左右,收集所有菌落,混匀分装即为Calu-3和A549细胞cDNA的酵母文库,并对文库库容、滴度及多样性进行分析。利用Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切将A/Auhui/2/2005(H5N1)NP定向插入pGBKT7载体,构建高致病性流感病毒NP的诱饵质粒p GBKT7-NP,经验证该质粒无自激活活性,并进一步采用构建完成的Calu-3/A549细胞酵母文库进行杂交筛选,筛选得到的正确阅读的猎物质粒与诱饵质粒共转Y2H Gold酵母菌,分别以BD-P53/AD-T7作为阳性对照和BD-Lam/AD-T7作为阴性对照,挑取最终在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/Aro A(SD/-4/X/A)固体培养板上生长良好且变蓝的菌落,即为候选与目标蛋白互作阳性的蛋白,提取酵母质粒,进行测序分析、序列比对和Gene Ontology分析。【结果】提取两种细胞RNA 28S与18S条带清晰,5S条带暗淡,表明所提RNA质量较高,基本无降解;对提取的RNA反转录纯化获得dscDNA,dscDNA条带呈弥散状,片段大小分布于500—2 000bp之间,说明不同丰度及大小的RNA均成功反转录;构建的dscDNA文库库容为1.5×10~7,滴度为2.2×10~8cfu/m L,重组率为88%,PCR鉴定文库插入片段,条带大小不一、多样性好;利用诱饵质粒与文库进行双杂交筛选,回交验证后得到11个与NP蛋白互作的宿主因子。经Gene Ontology分析显示,11个宿主因子参与的生物过程包括:细胞凋亡、胚胎发育、可变剪接、转录调节及细胞增殖等;涉及的分子功能包括:GTP结合活性、金属离子结合活性、DNA结合活性及转录因子活性。【结论】成功构建同时含有Calu-3和A549两种人源肺细胞cDNA的酵母文库,文库覆盖cDNA更全面,为后期筛选与流感病毒其它蛋白互作的宿主蛋白奠定基础,筛选得到与NP蛋白存在相互作用的宿主因子为进一步深入研究NP功能提供了可靠的前期数据。     

兰州地方分离PCV毒株ORF2阅读框的测序分析与原核表达鉴定

根据GenBank中发表的PCV1和PCV2的ORF2基因序列,设计合成了一对共用引物,用PCR的方法从兰州本地病料中分离出毒株,通过PK-15的增殖,扩增出ORF2序列,测序分析后发现分离毒株序列与PCV1的ORF2序列同源性达到99.1%～99.4%。根据GenBank中PCV2的ORF2序列对目的序列进行了改造、优化和合成后,目的序列和pET-32a载体连接,转化BL21（DE3）细胞后,挑取阳性克隆。对鉴定后的融合质粒用IPTG诱导,裂解液经过SDS-PAGE分析、纯化操作和Western-Bloting分析,表明改造合成ORF2序列在大肠杆菌中得到了表达,并能被PCV2阳性血清所识别。     

小反刍兽疫研究进展

小反刍兽疫病毒(PPRV)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的成员,主要感染山羊、绵羊等小反刍动物,引起一种高度接触性病毒性传染病。小反刍兽疫为一种重大的外来性疾病,2007年在中国西藏自治区日土县首次发生。自2013年末以来中国新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙、湖南、辽宁等地频繁暴发小反兽疫疫情,给中国的畜牧业带来了巨大的损失,引起极大的重视。为更好的分析小反刍兽疫的病原特性及采取有效的防控措施,文章对小反刍兽疫的病原学及疫苗研究进展进行论述。     

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.     

金丝桃素注射剂的制备及其含量的测定

采用高效液相色谱法(HPLC法)测定所制备的金丝桃注射液中金丝桃素的含量,测定时采用Chrom-sphere C18(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇-乙腈-1%磷酸盐缓冲液(v/v/v=170∶10∶10),流速为1 mL/min,检测波长588 nm.结果表明:线性范围为0.04~0.20μg,金丝桃素的含量是0.21%(相当于每毫升注射液含金丝桃素0.009 3 mg),RSD为1.07%.HPLC法灵敏、准确、重现性好,可用于金丝桃素注射液含量的测定.     

藏草乌水煎提取液体外杀灭羊虱蝇药效及皮肤毒性试验研究

试验旨在研究藏草乌的水煎提取液在体外杀灭羊虱蝇的药效作用及其皮肤毒性、刺激性、过敏性试验,为藏草乌的开发利用和临床应用提供理论依据。将1%、2%、4%、8%、10%藏草乌水煎提取液分别滴于衬有吸水纸和羊虱蝇的平皿中,在1、2、4、8h时分别观察其对羊虱蝇的杀灭情况。取相同剂量1%、2%藏草乌水煎提取液均匀涂于大白兔的完整皮肤和破损皮肤,进行皮肤毒性、刺激性和过敏性试验。结果显示,给药1h后各浓度的藏草乌水煎提取液及阳性对照组均出现了不同程度的羊虱蝇杀灭效果,4h后阳性对照组杀灭率为100%,8h时,1%、2%藏草乌水煎提取液杀灭率达到70%,而2%藏草乌水煎提取液较1%药物组杀灭羊虱蝇效果好;皮肤毒性试验显示,大白兔皮肤无红斑、水肿,体重变化正常;皮肤刺激性试验结果显示,藏草乌提取液对大白兔皮肤无刺激性;皮肤致敏反应结果表明,藏草乌提取液对大白兔不具有致敏性。综上所述,藏草乌水煎提取液具有良好的体外杀灭羊虱蝇作用,且皮肤用药安全。