犬瘟热与犬副流感病毒双重一步法RT-PCR检测方法的建立

为建立可以同时检测犬瘟热病毒(CDV)和犬副流感病毒(CPIV)的检测方法,依据GenBank中登录的CDV的H基因和CPIV的NP基因保守序列,设计合成扩增序列分别为593 bp (CDV H基因)、1 530 bp (CPIV NP基因)的2对引物,通过优化反应条件,建立一种能够同时检测CDV和CPIV的双重一步法RT-PCR检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法能特异地检测CDV和CPIV,其最低检测限分别为3.58×10~6拷贝/μL和1.74×10~6拷贝/μL。对51份临床疑似病料样品进行检测,同时分别采用商品化的CDV和CPIV抗原检测试剂盒进行检测,结果二者符合率为100%。该结果表明本实验所建立的双重一步法RT-PCR方法的灵敏度及特异性均较好,可用于临床相关疫病的诊断。     

抗BVDV Erns蛋白单克隆抗体制备及生物学特性鉴定

为制备抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns蛋白单克隆抗体,本试验用Erns重组蛋白免疫Balb/c鼠,刺激小鼠脾脏产生特异性免疫细胞;通过化学剂诱导剂PEG-4000诱导免疫细胞和骨髓瘤细胞融合,形成杂交瘤细胞;间接ELISA方法结合亚克隆方法筛选阳性细胞孔;鉴定为稳定分泌抗体的细胞株做扩大培养,细胞悬液计数并无菌注...     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化

为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。     

禽流感病毒B类等位基因NS1蛋白的原核表达、纯化及热稳定性分析

A型流感病毒的非结构蛋白基因(non-structural protein,NS)在进化上可以分为等位基因A和B,两者之间同源性低于70％;NS1是流感病毒对抗宿主免疫系统的主要毒力因子之一.本研究在序列比对分析的基础上,表达、纯化了本实验室保存的4株B类等位基因禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV) (A/duck/Hunan/S1256/12(H3N8),A/environment/Hunan/S4484/11(H12N7),A/duck/Guangdong/07/00(H5N1)和A/duck/Shanghai/08/01 (H5N1))的NS1蛋白,并对其进行稳定性分析.首先从感染的鸡胚尿囊液中提取病毒总RNA,利用特异引物Uni12反转录获得cDNA,以其为模板PCR扩增得到NS1全长片段,利用BamH Ⅰ和NotⅠ双酶切将其定向插入pGEX6P-1载体,大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中诱导表达.该蛋白在纯化过程中稳定性差,沉淀析出.为此,进一步构建NS1蛋白截短突变体(1M-202A,R38A/K41A),并在BL21菌株中诱导表达,经过GE health Glutathione sepharose 4B亲和层析、Source Q阳离子交换柱层析和Hitrap Superdex75分子筛凝胶层析逐步纯化,然后进行SDS-PAGE凝胶纯度分析,并测定OD320,进行蛋白热稳定性分析.结果表明,经进化分析,4株病毒均属于禽流感病毒B类等位基因群,4株病毒NS1蛋白经过全长野生型、全长突变体及截短突变体的逐步优化表达,截短突变体NS1蛋白表达质量相对较高,最终经过逐步纯化获得纯度达到90％以上的蛋白样品,且4株病毒中A/duck/Hunan/S 1256/12(H3N8)NS1蛋白的稳定性最好.研究结果为进一步研究其分子结构与功能提供了基础资料.     

兰州地区NDV的分离鉴定及M蛋白的原核表达

为了分离出兰州地区鸡群新城疫病毒(NDV,Newcastle disease virus)并将M蛋白进行原核表达。通过鸡胚尿囊腔接种培养分离得到的兰州地区NDV,采用血凝及血凝抑制实验和Western bolt对病毒进行鉴定。利用分子克隆方法将NDV M蛋白进行原核表达,用Western blot技术分析其反应原性。根据NCBI发表的NDV M基因构建进化树。结果表明,成功分离的NDV悬液经RT-PCR技术扩增出M基因片段,重组菌p ET-M经SDS-PAGE分析,在约42 k Da处有一明显的蛋白条带,Western blot技术证明其具有良好的反应原性。M基因进化树分析,分离毒株与La-Sota具有极高同源性。本研究成功分离出兰州地区NDV并将M蛋白进行原核表达,同时确定分离毒株与La-Sota毒株的同源性极高。为后续针对兰州地区新城疫流行病学调查和综合防控技术提供实验依据。     

羊口疮的研究

本文报道了对羊口疮的病原学、流行病学、实验病理学、血清学诊断以及免疫预防等问题所进行的系列研究结果。应用电镜技术,首次在国内观察到了羊口疮的病原——羊口疮病毒。对该病毒的某些生物学特性和理化学特性进行研究的结果表明,该病毒的感染范围比较广泛,对干燥耐受性强,对热、紫外光和福马林敏感;在奶山羊睾丸细胞上生长良好,CPE变化显著,并有多倍性现象;通过系统取样和超薄切片,在电镜下观察到了病毒在培养细胞中的主要复制过程,以及培养细胞本身的亚微结构变化。试用差速离心联用30—45％蔗精密度梯度超速离心,能有效地提纯病毒,为纯化痘类病毒提供了一种较为理想的方法。中性无离子去污剂TritonX—100与2—巯基乙醇联合,可使病毒裂解,便于分离囊膜蛋白亚单位;用SDS—PAGE分析法,发现病毒最少可泳动出28条多肽区带,而病毒的囊膜亚单位则由18条多肽区带组成。将病毒亚单位作为抗原免疫羔羊,可激发羊只产生抗全病毒抗体和迟发性变态反应,这在国内属首次报道。流行病学的调查表明,羊口疮在甘肃省存在历史已久,分布广泛,对养羊业危害严重;病的自然感染主要见于绵羊和山羊,以羔羊最为易感,除口唇感染外,未见其他临诊病型;采取不同地区的病羊痂皮在羊体作交叉免疫试验,未发现病毒有型别差异。人工感染病羊的血常规检查和血清蛋白的电泳分析未见异常;病理组织学变化以表皮的网状变性、真皮的炎性浸润和结缔组织增生为最特征。首次在国内将反向间接血凝、对流免疫电泳、酶联免疫吸附,琼脂凝胶扩散以及血清中和等五种血清学方法用于羊口疮的诊断,填补了国内在这方面的空白,其中前三种方法在当时的国外文献中也未见有报道。以改良、完善现行方法为目的,对活毒苗免疫接种法作了系统的研究,证明是一种行之有效的应急性免疫措施,有在疫区推广应用的价值;对灭活苗所进行的探索性试验表明,灭活的病毒似能激发羊体产生一定程度的免疫,为今后进一步提高灭活苗的免疫效果以及研究其在实践中应用的可能性打下了有益的基础。     

加强西藏兽药重点实验室建设促进畜牧业经济发展

兽药重点实验室是畜牧业科技创新体系的重要组成部分,缩短重点实验室源头创新和市场需求之间的距离,使重点实验室真正成为一支推动产业升级和结构调整的主力军,服务于区域畜牧业经济发展和应用性人才的培养。1建设目标建设西藏区内一流、国内先进、开放型的西藏兽药重点实验室,形成一支涵盖药物分析、生物制品和中药学等专业     

亲和层析和反相层析纯化O型口蹄疫病毒单抗的比较

为了获得有效纯化抗体的方法,将杂交瘤细胞株（4C3）用细胞培养液扩大培养后制备腹水,所得腹水依次用50％和45％的饱和硫酸铵沉淀后再分别用亲和层析和反相层析进一步纯化抗体,并用SDS—PAGE和间接酶联免疫吸附试验分析其纯化抗体的纯度和活性。结果表明,亲和层析获得了较高纯度的抗体,并且抗体活性没有丧失,反相层析获得的抗体有较好的活性,但抗体中还有微量的杂蛋白。因此亲和层析是单抗纯化的较好途径,所获得的高纯度单抗将为O型口蹄疫病毒的基础研究和应用研究提供良好的物质基础。