沉默囊泡分选蛋白(VPS)对辣椒疫霉效应因子RxLR504功能的影响

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要的病原卵菌,能产生大量的RxLR效应分子帮助病原菌定殖。前期实验证明RxLR504效应分子能够抑制INF1引发的细胞死亡,并证实囊泡分选蛋白(VPS)与其相互作用。本文借助VIGS tool在线工具设计靶标基因沉默片段;利用烟草脆裂病毒(TRV)介导的基因沉默技术(VIGS)沉默本氏烟靶标基因;提取沉默样品叶片组织RNA,构建c DNA文库;利用qRT-PCR检测靶标基因表达水平;在沉默植株叶片上表达RxLR504,24 h后接种INF1,观察病斑症状。结果表明:本氏烟中设计沉默片段长度为300 bp,构建c DNA文库质量较高;荧光定量PCR结果显示,沉默植株中靶标基因表达水平下降86.2%,与对照相比差异性显著;接种实验证明RxLR504在沉默植株与对照植株上均能抑制INF1引发的细胞死亡。RxLR504与VPS互作不影响其抑制INF1引起的细胞坏死,为进一步揭示病原物利用植物靶标基因抑制植物免疫从而促进自身寄生的机制打下基础。     

山羊MC1R基因克隆、表达及其多态性研究

为研究黑色素皮质素受体1(MC1R)基因与山羊毛色形成的相关性,以苏淮山羊和波尔山羊为研究对象,克隆测序获得了山羊MC1R基因编码区全序列,实时定量荧光PCR(Real-Time PCR)检测其在苏淮山羊和波尔山羊耳组织中的表达水平,DNA池方法筛选其在山羊群体中的SNPs位点。结果发现,MC1R基因在苏淮山羊中全长954 bp,编码317个氨基酸残基。波尔山羊和苏淮山羊MC1R基因核苷酸和氨基酸序列一致性为99.79%和98.77%;系统进化分析发现,波尔山羊与苏淮山羊聚在一起后再与绵羊聚在一起。在苏淮山羊群体中发现183C/T和748T/G 2个突变位点,在波尔山羊群体中检测到701G/A突变。MC1R基因在波尔山羊耳组织中的表达水平高于苏淮山羊,但差异不显著。该研究显示MC1R基因可能在调控山羊毛色形成中发挥一定的作用。     

实时荧光定量PCR技术的概述及应用

实时荧光定量PCR技术是在传统PCR技术上发展而来的,不仅能判断某一基因的有无,而且还能对其进行定量分析。由于该技术与常规PCR相比,能够进行实时监测、且自动化程度高而被广大研究者青睐。本文对实时荧光定量PCR的原理、数据分析、定量方法、分类以及应用进行了系统而详细地综述。     

白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答

【目的】酚氧化酶（phenoloxidase,PO）是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原（prophenoloxidase,PPO）形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱（Sogatella furcifera）3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照组,通过注射合成的dsSfPPO后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的开放阅读框长度分别为2 079、999、2 070 bp,分别编码692、332、689个氨基酸,预测蛋白分子量分别为79.84、37.67、79.53 kD,等电点分别为6.43、9.56、6.20。生物信息学分析表明,白背飞虱的3个PPO蛋白具有较高的同源性,且与褐飞虱（Nilaparvata lugens）的亲缘关系最近;SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2均在成虫第3天表达量最高,其中SfPPO2-1和SfPPO2-2的发育表达模式相似;SfPPO1和SfPPO2-1在表皮和脂肪体内表达量较高,而SfPPO2-2在翅和脂肪体内表达量较高,在头、足、中肠、马氏管中表达量相对较低;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后都能够显著沉默目的基因的表达,而且当SfPPO2-1表达被沉默后,SfPPO1出现显著高表达,说明不同的PPO之间可能具有补偿功能;大肠杆菌诱导后12 h,SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量显著升高,SfPPO1表达量则在诱导24 h后显著升高;枯草芽胞杆菌诱导24 h后,SfPPO1、SfPPO2-1和SfPPO2-2表达量均显著升高。【结论】SfPPO1、SfPPO2-1、SfPPO2-2的表达存在组织和龄期特异性,且在不同菌诱导情况下存在免疫应答差异性。研究结果有助于更加全面、深入地探索白背飞虱酚氧化酶在调控昆虫发育及免疫中的潜在分子机理。     

莲藕中甘薯潜隐病毒实时荧光定量PCR检测技术的建立及应用

甘薯潜隐病毒莲藕分离物（sweet potato latent virus-lotus，SPLV-lotus）在江苏省莲藕产区普遍引起发病，并且该分离物序列与已报道的SPLV甘薯分离物存在较大差异。为进一步监测SPLV-lotus在莲藕上的发生情况，针对SPLV-lotus的CP基因设计并优化特异性引物QSPLV-lotus3-F/QSPLV-lotus3-R，通过优化引物浓度和退火温度条件，构建标准曲线，建立了SPLV-lotus实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测技术。该方法特异性强，可以快速检测出SPLV-lotus，灵敏度为普通PCR的100倍，可广泛应用于脱毒莲藕SPLV-lotus的精确检测。     

多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆

采用多重实时荧光PCR技术,对大豆筛选基因35S启动子(cauliflower mosaic virus,CaMV 35S)、NOS终止子(nopaline synthase,NOS)和内源基因Lectin设计合成了多对检测引物和探针,在筛选各基因合适的检测引物和探针的基础上,摸索引物组合和扩增条件,最终确定合适的探针引物组合和试验条件,建立转基因大豆快速初筛技术。该方法可在1 h内同时完成对转基因大豆3个基因片段的实时荧光PCR检测。方法特异性强,灵敏度高,可用于大豆转基因成分的快速检测,大大提高检验效率,可为消费者的食品安全及我国大豆的进出口检验提供有效的技术支持。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。